前列腺素E2和白三烯B4對(duì)調(diào)節(jié)民生T細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：初始CD4+T細(xì)胞接受抗原刺激后，首先分化為Th0細(xì)胞，在不同的細(xì)胞因子作用下，可分化為Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞，發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。Treg細(xì)胞具有免疫抑制作用，主要功能是維持免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)，并與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)密切相關(guān)。Treg細(xì)胞是由CD4+T細(xì)胞在TGF-β的作用下分化而來(lái)，而叉狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(FOXP3)是檢測(cè)CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化程度的特異性轉(zhuǎn)錄因子。
　　 前列腺素E2

2、(PGE2)和白三烯B4(LTB4)均為花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，是RA病程中的重要炎癥介質(zhì)。目前，臨床上多用非甾體類抗炎藥治療RA，其作用機(jī)制正是通過(guò)抑制環(huán)氧化酶進(jìn)而抑制PGE2的生成。有研究表明，應(yīng)用LTB4受體阻斷劑可以治療RA。本室以往研究證實(shí)，PGE2通過(guò)前列腺素受體EP2和EP4抑制Th0細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。LTB4可抑制Th0分化為Treg細(xì)胞，且抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠Th0細(xì)胞分化為Tre

3、g細(xì)胞，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。那么，PGE2和LTB4是否可以調(diào)節(jié)人CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞的分化，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，因此本課題以人外周血CD4+T細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察PGE2和LTB4對(duì)Treg細(xì)胞分化的影響，進(jìn)而確定PGE2和LTB4是否通過(guò)調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的分化，參與人體的免疫調(diào)節(jié)，以期進(jìn)一步揭示二者在RA中的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：
　　 1、PGE2對(duì)Treg細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)
　　 (1)免疫磁珠法分

4、選人外周血CD4+T細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選細(xì)胞的純度；收集分選后的細(xì)胞，接種于anti-CD3預(yù)先包被的24孔板，加入anti-CD28和TGF-β1，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，于不同時(shí)間收集細(xì)胞，觀察FOXP3 mRNA的時(shí)間依從性表達(dá)；收集分選后的細(xì)胞，接種于anti-CD3預(yù)先包板的24孔板，加入anti-CD28、TGF-β1和IL-2，7d后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞數(shù)量。

5、　　 (2)不同濃度PGE2對(duì)Treg細(xì)胞分化的影響。PGE2對(duì)Treg細(xì)胞FOXP3mRNA表達(dá)的影響：分為四組，對(duì)照組和PGE2(0.1μM、1μM、10μM)組，孵育36h，收集細(xì)胞，觀察FOXP3mRNA的表達(dá)情況；不同時(shí)間10μMPGE2對(duì)Treg細(xì)胞分化的影響：分為對(duì)照組和PGE210μM組，于不同時(shí)間收集細(xì)胞，觀察FOXP3mRNA的表達(dá)情況；PGE2對(duì)CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞數(shù)量的影響：分為四組，對(duì)照組和PG

6、E2(0.1μ.M、1μM、10μM)組，培養(yǎng)7d，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)觀察CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞的數(shù)量。
　　 2、LTB4對(duì)Treg細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)LTB4對(duì)Treg細(xì)胞FOXP3 mRNA表達(dá)的影響：分為四組，對(duì)照組和LTB4(0.01μM、0.1μM、1μM)組，孵育36h，收集細(xì)胞，觀察FOXP3mRNA的表達(dá)情況；LTB4對(duì)CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞數(shù)量的影響：分為四組，對(duì)照組和LTB4(0.01μ

7、M、0.1μM、1μM)組，培養(yǎng)7d，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞的數(shù)量。
　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較，P＜0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、PGE2對(duì)Treg細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)
　　 (1)經(jīng)磁珠分選后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T細(xì)胞的

8、純度達(dá)97％以上；在anti-CD3和anti-CD28，TGF-β1作用下Treg細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子FOXP3 mRNA在36h達(dá)表達(dá)高峰；在anti-CD3和anti-CD28存在的條件下，TGF-β1和IL-2作用7d后，可使(72.9533±17.2270)％的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD4、CD25和FOXP3，證明體外成功誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞。
　　 (2)不同濃度的PGE2在CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)分化為Treg細(xì)胞3

9、6h時(shí)均對(duì)FOXP3 mRNA的表達(dá)有抑制作用，且呈劑量依賴性，PGE2(0.1μM、1μM、10μM)組(0.8544±0.0745、0.6972±0.1047、0.2220±0.0377)與對(duì)照組(1.0000±0.0000)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同時(shí)間10μM PGE2對(duì)Treg細(xì)胞FOXP3mRNA的表達(dá)均有抑制作用，且在7d時(shí)抑制作用最明顯，5d和7d時(shí)，PGE210μM組(4.1127±0.5213、3.6510±0.5

10、057)與對(duì)照組(10.0970±1.7363、21.0310±4.1888)相比，有顯著差異;PGE2作用7d，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞的數(shù)量：發(fā)現(xiàn)PGE2(0.1、1、10μM)組均可減少CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞的數(shù)量，且呈劑量依賴性，PGE21μM和10μM組(41.4933±9.5664、23.9367±5.3066)％與對(duì)照組(72.9533±17.2270)％相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

11、　 上述結(jié)果顯示PGE2抑制CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞的分化。
　　 2、LTB4對(duì)Treg細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)
　　 不同濃度的LTB4在CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)分化為Treg細(xì)胞36h時(shí)，LTB4(0.01μM、0.1μM、1μM)組(0.9757±0.2335、1.0058±0.1900、1.0779±0.2348)與對(duì)照組(1.0000±0.0000)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;LTB4作用7d后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+

12、CD25+FOXP3+細(xì)胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)LTB4(0.01μM、0.1μM、1μM)各組(78.7000±12.9752、76.5200±9.9611、77.8133±13.8570)％與對(duì)照組(72.9533±17.2270)％相比，無(wú)顯著差異。
　　 上述結(jié)果顯示LTB4對(duì)CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞的分化無(wú)明顯影響。
　　 結(jié)論：
　　 (1)通過(guò)磁珠分選人外周血CD4+T細(xì)胞，成功誘導(dǎo)其向Treg細(xì)胞分化，