臨床常見曲霉菌體外藥物敏感性及分子生物學(xué)鑒定方法研究.pdf

1、[目的]探討臨床常見曲霉菌（煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉）對經(jīng)典的抗真菌藥物伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B和新的抗真菌藥物泊沙康唑、卡泊芬凈的體外敏感性：建立應(yīng)用實時熒光PCR技術(shù)將臨床常見曲霉菌鑒定至種的水平。
　　 [方法]對所收集的真菌通過形態(tài)學(xué)和/或分子生物學(xué)鑒定，采用濃度梯度法（E-test）測定伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、兩性霉素B及卡泊芬凈對5種曲霉菌的最低抑菌濃度（MIC）；采用液氮研磨、試劑盒純化

2、方法提取曲霉菌細胞核DNA，普通PCR方法擴增5種（47株）曲霉菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS），測序獲得ITS區(qū)序列，基于不同種曲霉菌的ITS區(qū)序列對種特異性探針進行驗證和改進，建立實時熒光PCR方法將常見曲霉菌通過特異性探針解鏈溫度（Tm）的差異進行區(qū)分并對該方法的靈敏度、特異性及重復(fù)性進行評價。
　　 [結(jié)果]形態(tài)學(xué)觀察基本上能將臨床常見的5種曲霉菌鑒定到種，對于其他種屬形態(tài)學(xué)可以將其鑒定到屬的水平，但是較難鑒定到種。卡泊芬凈對

3、煙曲霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉的MIC90均為0.094μg/ml，對黑曲霉的MIC90為0.19μg/ml，在5種藥物中最低；泊沙康唑?qū)ν燎沟腗IC90最低，為0.094μg/ml；對于煙曲霉和黃曲霉，MIC90由低到高依次為卡泊芬凈、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B；土曲霉對兩性霉素B的MIC均>32μg/ml。MasterPureTM Yeast DNA Purification Kit提取的DNA量很低，固體培養(yǎng)+液氮研磨方

4、法、液體培養(yǎng)+液氮研磨方法以及固體培養(yǎng)+液氮研磨+試劑盒純化方法提取的DNA OD260/OD280的均值分別為1.73、1.96和1.80。煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉種特異性探針Tm值分別為61.4℃、57.4℃、67.7℃、65.8℃，土曲霉特異性探針的Tm值為64.5℃和55.2℃。實時熒光PCR方法對煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉的檢測下限分別為56.8fg、1110fg、13.7fg、123fg、780fg。疣

5、狀瓶霉和小孢根霉能與煙曲霉特異性探針發(fā)生交叉反應(yīng)。該方法在每次重復(fù)實驗中Tm值的波動在0.5℃以內(nèi)。
　　 [結(jié)論]形態(tài)學(xué)結(jié)合rDNAITS區(qū)測序?qū)φ婢N的鑒定很有幫助。Etest法體外藥敏結(jié)果顯示，新的棘白素類抗真菌藥物卡泊芬凈對五種曲霉具有很好的體外抗菌活性，唑類藥物對于曲霉菌的體外抗菌活性優(yōu)于兩性霉素B。采用固體培養(yǎng)+液氮研磨法+試劑盒純化法能獲得高純度的曲霉菌DNA。實時熒光PCR方法具有很好的靈敏度、特異性和重復(fù)性，能