柔嫩艾美耳球蟲HF株的分離鑒定及其致病性研究.pdf

1、雞球蟲病是一種由艾美耳屬球蟲引起的呈世界性分布的寄生蟲病，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。雞球蟲種類多，臨床多呈混合感染，其中致病性最強的是柔嫩艾美耳球蟲。本研究通過對瓊脂分離單球蟲卵囊方法進行改進，建立了球蟲單卵囊膠囊分離技術(shù)，應用該技術(shù)成功地分離出一株球蟲，即柔嫩艾美耳球蟲合肥(HF)株，并對其致病性進行了研究。 首先，從合肥市肥西縣選擇具有球蟲病典型癥狀的病雞，取其盲腸內(nèi)容物，用沉浮法收集柔嫩艾美耳球蟲的野外混合株，加入適量的

2、2.5％重鉻酸鉀溶液，置于27℃恒溫箱中培養(yǎng)。查閱有關(guān)資料，對球蟲單卵囊分離方法進行了改進，建立了一種新的球蟲單卵囊分離方法，即球蟲單卵囊膠囊分離技術(shù)：用2％瓊脂塊分離到一個球蟲卵囊后，用膠囊封好，制成單卵囊膠囊。將膠囊經(jīng)口接種8只5日齡無球蟲雛雞，進行單卵囊膠囊人工感染試驗。從第4天起，每天收集糞便，檢查卵囊排出情況，第12天剖殺全部雛雞。結(jié)果，8只雞中有3只感染成功，感染成功率為37.5％。 其次，對所分離到的蟲株進行形態(tài)學

3、鑒定。將上述單卵囊后代經(jīng)12日齡無球蟲雛雞增殖兩代，對連續(xù)兩代卵囊進行形態(tài)觀察，測得第一代(150個)卵囊的大小為16.8～24.6μm×16.1～20.7μm，平均大小為21.24μm×18.14μm。卵形指數(shù)為1.17。孢子囊大小為10.10～12.95μm×4.40～7.25μm，平均大小為11.60μm×5.99μm。第二代(150個)卵囊的大小為17.6～23.3μm×15.5～20.5μm，平均大小為21.11μm×18.0

4、4μm，卵形指數(shù)為1.17。孢子囊大小為10.10～12.95μm×4.60～7.25μm，平均大小為11.59μm×6.01μm。對兩次測量數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗(F檢驗)，其結(jié)果差異不顯著，而且第二代球蟲的寄生部位和病理變化與第一代相同，結(jié)果都符合柔嫩艾美耳球蟲的特征，因此初步鑒定本試驗分離的球蟲為柔嫩艾美耳球蟲，暫命名為柔嫩艾美耳球蟲合肥(HF)株。 再次，采用飽和食鹽溶液濃縮卵囊，高速組織勻漿機破碎卵囊，用基因組抽提試劑

5、盒提取卵囊基因組。參照Schnitzler,B.E.等設計的引物：5'-AATTTAGTCCATCGCAACCCT-3，；5'-CGAGCGCTCTGCATACGACA-3'進行PCR反應，成功擴增出278bp的特異性片斷。對擴增片斷進行克隆測序，并在網(wǎng)上進行blast分析，表明所擴增的基因序列與已報道的柔嫩艾美耳球蟲標準株基因序列有高度同源性。 最后，將柔嫩艾美耳球蟲HF株感染雛雞，并從臨床癥狀、病變積分、病理變化等方面進行致

6、病性分析。結(jié)果顯示：當接種1.0×104個卵囊時就引起雛雞死亡，致死率為10％；接種2.0×104個卵囊時，致死率為20％；接種4.0×104個卵囊時致死率為30％；接種8.0×104個卵囊時致死率為70％；接種1.6×105個卵囊時致死率達90％。表明隨著卵囊接種量的增多，雛雞死亡率也隨之增高。說明柔嫩艾美耳球蟲HF株的致病力很強。 綜上所述，本研究成功地建立了一種新的球蟲單卵囊分離技術(shù)，應用此技術(shù)分離到一株柔嫩艾美耳球蟲，對