蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)男性不育精漿相關(guān)蛋白質(zhì)群的分析.pdf

1、男性不育是引起不孕癥的重要因素之一。據(jù)2000年世界衛(wèi)生組織報(bào)道，在全世界約8000萬對(duì)不孕不育夫婦中，男方因素約占40％，女方因素約占50％，男女雙方因素約占10％。在我國，根據(jù)對(duì)河北省10個(gè)地區(qū)39476對(duì)育齡夫婦抽樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)男性不育者占33.15％。導(dǎo)致男子不育的原因非常復(fù)雜廣泛，涉及生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)和功能、激素調(diào)節(jié)、遺傳物質(zhì)、感染免疫等諸多因素的異常和障礙?，F(xiàn)階段對(duì)這些因素的研究大多停留在單基因水平和基因組水平。然而，機(jī)體真正

2、生理機(jī)能的執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，所以上述分子遺傳學(xué)研究并不能反映基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控、蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化以及蛋白質(zhì)的翻譯后修飾等信息，并且細(xì)胞內(nèi)mRNA水平和蛋白質(zhì)的表達(dá)峰度并不完全一致，因此從蛋白質(zhì)水平對(duì)男性不育機(jī)制進(jìn)行研究顯得特別重要。 目前對(duì)蛋白組學(xué)研究多是采用經(jīng)典的雙向電泳技術(shù)，通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子質(zhì)量的不同而進(jìn)行分離，這種方法對(duì)于分子質(zhì)量較大、含量較多的蛋白質(zhì)有很好的分離作用。但不利于小分子質(zhì)量、微量蛋白質(zhì)的分離與鑒定。

3、 蛋白質(zhì)芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(Surface Enhanced Laser Desorption/lonization-Time of Flight Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS)是1993年后才發(fā)展的起來的一項(xiàng)新的蛋白質(zhì)研究技術(shù)，是繼基因芯片之后發(fā)展起來的生物檢驗(yàn)技術(shù)，是蛋白芯片與表面加強(qiáng)激光解吸電離飛行質(zhì)譜的技術(shù)組合。它以其高度并行性、高通量、微型化和自動(dòng)化的特點(diǎn)而很快成為研究蛋白質(zhì)組學(xué)的有力工

4、具。其優(yōu)越性主要表現(xiàn)在：可直接用未經(jīng)純化的樣品進(jìn)行分析；樣品需求量少，通常只要數(shù)微升；靈敏度高，有利于檢出低豐度蛋白；高通量，可以快速發(fā)現(xiàn)多個(gè)生物標(biāo)記物，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析；有多種不同表面性質(zhì)的芯片可供選擇，有利于發(fā)現(xiàn)一些具有特性的蛋白。所以SELDI-TOF-MS在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域是對(duì)雙向電泳技術(shù)的有力補(bǔ)充。受目前常規(guī)檢測(cè)手段的局限，人們未能從整體上系統(tǒng)地分析精漿中的蛋白質(zhì)群及其作用，因此針對(duì)精液異常的男性不育患者，進(jìn)行精漿的系列比較蛋

5、白組學(xué)研究，確立與不育發(fā)生相關(guān)的重要蛋白質(zhì)群，揭示關(guān)鍵蛋白的分子作用機(jī)制和相互作用網(wǎng)絡(luò)，是尋找不育原因的一條新思路。 本研究旨在利用蛋白質(zhì)芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)這種新的蛋白組學(xué)研究方法，對(duì)精液液化延遲、非阻塞性無精癥、嚴(yán)重少精癥等多種男性不育癥患者精漿與正?？缮行跃珴{進(jìn)行檢測(cè)，比較正常與各不育組之間是否存在差異蛋白，差異蛋白的數(shù)量及相應(yīng)的分子量。彌補(bǔ)常規(guī)2D-PAGE蛋白組研究方法對(duì)小分子質(zhì)量、微

6、量蛋白無法檢測(cè)的缺陷。 研究方法: 本研究中以29例精液標(biāo)本為研究對(duì)象，按WHO《不育標(biāo)準(zhǔn)檢查與診斷手冊(cè)》進(jìn)行分類：其中精液正常組11例，精液液化延遲組7例，非阻塞性無精組6例，嚴(yán)重少精癥(偶見活精)組5例。精液標(biāo)本離心后分離精漿。應(yīng)用CM10蛋白芯片捕獲蛋白；蛋白質(zhì)離子化后，用PBS IIC型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)對(duì)不同組精漿蛋白進(jìn)行檢測(cè)，獲得各樣本的蛋白指紋圖譜。應(yīng)用BioMarker Wizard軟件對(duì)所測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行歸一

7、化處理，Ciphergen ProteinChip Software 3.1軟件分別對(duì)精液液化延遲組與正常組、非阻塞性無精癥組與正常組、嚴(yán)重少精癥組與正常組、嚴(yán)重少精癥組與非阻塞性無精癥組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。比較幾組間存在的差異蛋白數(shù)量、強(qiáng)度。在Swiss-Prot和TrEMBL蛋白質(zhì)庫中對(duì)P<0.01的差異蛋白進(jìn)行初步篩選。 結(jié)果: 1.正常組與液化延遲組正常組與液化延遲組比較，有19個(gè)蛋白表達(dá)存在差異。 其中在液

8、化遲緩組表達(dá)較正常組高的蛋白有10個(gè)，其分子質(zhì)量分別為：8696.621 Da，9770.076 Da，9512.309 Da，10202.64 Da，9617.759 Da，10119.41Da，12345.16 Da，12542.41 Da，9407.785 Da，16517.9 Da(P<0.05)；其中分子質(zhì)量為8696.621 Da，9770.076 Da，9512.309 Da，10202.64 Da，9617.759 Da

9、的5個(gè)蛋白表達(dá)增高明顯，P<0.01。 在液化遲緩組表達(dá)降低的蛋白有9個(gè)，其分子質(zhì)量分別為：2941.903 Da，2669.629 Da，2127.706 Da，2922.53 Da，2688.064 Da，3454.267 Da，3602.682 Da，7596.921 Da，7630.573 Da(P<0.05)；其中分子質(zhì)量為2941.903 Da的蛋白質(zhì)表達(dá)明顯降低，P<0.01。 蛋白質(zhì)庫查詢P<0.01的幾

10、種差異蛋白，提示其中4種蛋白可能是：Zincfinger protein；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶同功酶；動(dòng)力蛋白輕鏈；細(xì)胞色素氧化酶多肽。 2.正常組與無精組正常組與無精組比較，有28個(gè)蛋白表達(dá)存在差異。 在無精組除分子質(zhì)量分別為：5423.645 Da，9617.759 Da，10778.81 Da，5379.173 Da的四個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)增高外，其余24個(gè)差異蛋白質(zhì)表達(dá)均較正常組降低，P<0.05。其中分子質(zhì)量分別為7196.

11、058 Da，7630.573 Da，7547.61 Da，7709.833 Da的4個(gè)蛋白含量明顯下降，有顯著性差異，P<0.01。 蛋白質(zhì)庫查詢P<0.01的幾種差異蛋白，提示其中1種蛋白可能是：絲氨酸酶抑制因子Kazal型前體。 3.正常組與偶見活精組 正常組與偶見活精組蛋白表達(dá)差異不大，僅有兩個(gè)低豐度蛋白存在表達(dá)差異。均表現(xiàn)為在嚴(yán)重少精組表達(dá)降低，其分子質(zhì)量分別為：2806.517 Da，15313.23

12、Da(P<0.05)。 4.偶見活精組與無精組偶見活精組與無精組相比，有15個(gè)蛋白存在表達(dá)差異。 在無精組表達(dá)增高的蛋白有6個(gè)，其分子質(zhì)量分別為：10860.9 Da，5379.173Da，10202.64.Da，10778.81 Da，13788.28 Da，13856.4：Da(P<0.05)。 在無精組表達(dá)降低的蛋白有9個(gè)，其分子質(zhì)量分別為：2647.87 Da，7196.058Da，7547.61 Da，

13、5780.493：Da，6393.921：Da，7013.909 Da，7059.844 Da，7409.589Da，8621.5 Da(P<0.05)。 結(jié)論: 1.蛋白質(zhì)芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)可以同時(shí)、快速對(duì)試驗(yàn)組與對(duì)照組之間是否存在差異蛋白進(jìn)行確定，并可同時(shí)檢測(cè)出多種差異蛋白標(biāo)志物，是差異蛋白組學(xué)研究的較好方法。 2.在精液液化過程除了一些研究清楚的較大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)參與外，還有眾多小分子蛋白參與這一重要

14、的生理過程。其中4種蛋白可能是：Zinc finger protein；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶同功酶；動(dòng)力蛋白輕鏈；細(xì)胞色素氧化酶多肽。 3.絲氨酸酶抑制因子可能參與精子的發(fā)生過程。 創(chuàng)新: 1.首次用SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)多種男性不育相關(guān)疾病的精漿進(jìn)行檢測(cè)。 2.首次報(bào)道了精液液化延遲患者中還存在大量小分子蛋白質(zhì)參與這一過程，可能包括Zinc finger protein；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶同功酶；動(dòng)力蛋白