奶牛附紅細胞體病PCR檢測方法的建立及其病原生物學初步研究.pdf

1、奶牛附紅細胞體病是一種日益受到人們關注的人畜共患病，病原是牛溫氏附紅細胞體。該病近年來給我國養(yǎng)牛業(yè)造成了較嚴重的經濟損失。針對目前國內還尚未在分子水平上證實該病原的存在，對其分類學地位不清楚及鏡檢作為檢測該病普遍采用的方法存在許多不足等情況。本文對奶牛附紅細胞體的16SrRNA基因進行了克隆、測序，并依此建立系統(tǒng)發(fā)肓進化樹，旨在從分子水平上確定其分類學地位。并且根據(jù)所得16SrRNA基因序列設計引物，建立了奶牛感染附紅細胞體的PCR診斷

2、方法。 本研究利用原核生物16SrRNA基因通用引物27F和1492R對分離純化的疑似奶牛附紅細胞體進行16SrRNA基因的PCR擴增及克隆測序。測序結果表明，目的片段長度為1439bp，其核苷酸序列與國外已發(fā)表的牛溫氏附紅細胞體(E.wenyoni)的16SrRNA基因片段同源性高達97.1﹪，暫稱為中國廣西株(E.wenyoni-CGX)；系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，E.wenyoni-CGX和其它血營養(yǎng)菌在系統(tǒng)進化關系上組成了一個

3、大的進化分支，與支原體科、支原體屬的病原最接近(75﹪)，而與立克次氏體科的病原較遠(55﹪)。分析結果支持了Neimark等和Messick等提出的將這類血營養(yǎng)菌劃歸入支原體科、支原體屬的建議。 同時，根據(jù)測序得到的奶牛附紅細胞體16SrRNA基因序列，設計一對種特異性引物，建立奶牛附紅細胞體病的PCR診斷方法。特異性試驗和敏感性試驗表明，該診斷方法與豬肺炎支原體、雞毒支原體、大腸桿菌、腸道沙門氏菌、葡萄球菌、雞艾美耳球蟲、牛

4、雙芽巴貝斯焦蟲無交叉反應；能檢測的奶牛附紅細胞體陽性血樣DNA最低濃度為0.154ng/μL，同時能檢測出在4℃存放長達三個月的血樣。通過臨床血樣檢測，證明該方法可以用于本病的診斷。 另外，建立了奶牛附紅細胞體病和伊氏錐蟲病的二重PCR診斷方法，其擴增片段大小分別為415bp和227bp。特異性試驗和敏感性試驗表明，該方法與豬肺炎支原體、大腸桿菌、葡萄球菌、雞艾美耳球蟲、牛雙芽巴貝斯焦蟲無交叉反應；能檢測的奶牛附紅細胞體陽性血液

5、DNA最低濃度和伊氏錐蟲陽性血液DNA最低濃度分別為0.43ng/μL和0.106ng/μL。臨床試驗表明，該方法可用于奶牛附紅細胞體病和伊氏錐蟲病的診斷。 為了初步探索不同種動物附紅細胞體之間是否存在交叉感染，本研究首先摸索體外培養(yǎng)水牛紅細胞的最佳條件，然后用染色鏡檢為附紅細胞體陽性的人、奶牛、小白鼠、狗、貓和兔紅細胞在體外感染陰性的水牛紅細胞。試驗結果表明：當PH值為7.2，CO2為6﹪，1640為基礎培養(yǎng)，含胎牛血清40﹪

6、的完全培養(yǎng)基可用于水牛紅細胞的培養(yǎng)，在體外可以成功培養(yǎng)長達30天；在體外交叉感染試驗中，奶牛和貓的附紅細胞體最易感染水牛，其感染率可達60﹪以上，其次是小鼠和狗，其感染率在30-40﹪之間，最低為兔，感染率只能達到15﹪，而人的附紅細胞體在體外不能感染水牛紅細胞。 本研究通過對不同種動物附紅細胞體血液涂片染色、體外培養(yǎng)及體外交叉感染，一定水平上反應了不同種動物附紅細胞體間的生物學聯(lián)系與區(qū)別。通過對奶牛附紅細胞體16SrRNA基因