天麻F1代RAPD及ISSR分子標(biāo)記研究.pdf

1、目的：利用RAPD和ISSR標(biāo)記對天麻進(jìn)行種質(zhì)鑒定，建立天麻RAPD和ISSR分子標(biāo)記指紋圖譜和聚類圖，分析12個(gè)樣品的遺傳多樣性，為天麻的遺傳、育種及種質(zhì)資源的保護(hù)和合理利用提供依據(jù)。
　　方法：1.本研究以貴州省境內(nèi)畢節(jié)、大方、遵義不同種型的藥用天麻的栽培品種F1代共12個(gè)樣品為材料，采用改良CTAB法提取天麻F1代基因組DNA。
　　2.利用改良 CTAB提取方法提取 DNA,參考蘭科部分植物多態(tài)性隨機(jī)引物,篩選出2個(gè)

2、重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng)的引物擴(kuò)增進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。
　　3.運(yùn)用單因素影響試驗(yàn)建立ISSR-PCR反應(yīng)體系，
　　4．從10個(gè)ISSR引物中篩選出2個(gè)能得到有效擴(kuò)增的引物，并通過對退火溫度和循環(huán)次數(shù)的試驗(yàn)，建立適用于這2個(gè)ISSR引物的PCR程序。通過UPGMA聚類構(gòu)建樹狀圖，對12個(gè)樣品遺傳關(guān)系進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：1．通過改良CTAB法提取天麻基因組DNA所需時(shí)間相對較短，純度較高，提取出來的DNA其OD260/280

3、在1.70-1.90范圍內(nèi)；
　　2.篩選出2個(gè)重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng)的引物擴(kuò)增進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共得到138條帶,其中92條表現(xiàn)出多態(tài)性,占總帶數(shù)的66.67％，擴(kuò)增位點(diǎn)分子量在200-2000bp之間。天麻的多態(tài)位點(diǎn)百分率在66.92%-85.9%。UPGMA聚類圖表明.紅天麻基本聚為一類，烏天麻聚為一類。
　　3．獲得適用于本實(shí)驗(yàn)室的ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序如下：PCR反應(yīng)體系：每20μl的擴(kuò)增反應(yīng)混合液包括10

4、× buffer2μl,25mLMgCl2（3.25mmol/L），dNTP（0.25mmol/L），引物(3μmol/L)，1U Taq酶（上海生工），以及25ngDNA模板；PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；40次循環(huán)，包括94℃變性1min，52-56℃退火1min，72℃延伸1.5min（Touch-down PCR），72℃延伸5min。其中退火溫度因引物不同而異。
　　4．篩選出2個(gè)引物用于12個(gè)天麻樣品的ISSR

5、-PCR擴(kuò)增，總共得到128個(gè)條帶，其條帶大小在200-2000bp范圍內(nèi)；天麻的多態(tài)位點(diǎn)百分率在66.7%-88.9%。UPGMA聚類圖表明，紅天麻基本聚為一類，烏天麻聚為一類，與RAPD標(biāo)記基本吻合。
　　結(jié)論：1.采用改良CTAB法從天麻干品藥材提取的基因組DNA純度較好，濃度較高，適合PCR擴(kuò)增。
　　2.本實(shí)驗(yàn)室天麻干品藥材的ISSR-PCR反應(yīng)體系和程序中，適宜的退火溫度為52-56℃。
　　3.不同產(chǎn)地的