斑馬魚G6PD酶活性的測定及突變型g6pd基因質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、目的：檢測斑馬魚不同組織、不同時相胚胎的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）酶活性。構(gòu)建g6pd-pCS2+、mutant g6pd-pCS2+、g6pd-EGFP-pCS2+、mutant g6pd-EGFP-pCS2+重組質(zhì)粒。觀察斑馬魚中g(shù)6pd的表達情況，為構(gòu)建G6PD缺乏癥的斑馬魚疾病模型奠定基礎(chǔ)。
　　方法1．運用改良的G6PD定量比值法檢測成年斑馬魚各

2、組織以及不同時相的胚胎中G6PD酶活性；2．重組質(zhì)粒的構(gòu)建：（1）提取野生型斑馬魚Total RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為斑馬魚cDNA，通過RT-PCR法克隆得到斑馬魚g6pd基因全長，將g6pd基因與pCS2+空載體連接獲得g6pd-pCS2+重組質(zhì)粒；（2）利用g6pd-pCS2+重組質(zhì)粒制備地高辛標(biāo)記的反義mRNA探針，在野生型斑馬魚Tuebingen進行原位雜交，觀察g6pd基因的表達情況；（3）g6pd-pCS2+重組質(zhì)粒鑒定正

3、確后，運用重疊延伸定點誘變原理設(shè)計出突變型mutant g6pd基因，將mutant g6pd基因與EGFP-pCS2+質(zhì)粒重組構(gòu)建突變型mutant g6pd-EGFP-pCS2+重組質(zhì)粒。3．利用RT-PCR檢測成年斑馬魚各組織以及不同時相的胚胎g6pd基因mRNA水平表達情況；4．利用顯微注射技術(shù)將mutant g6pd-EGFP-pCS2+重組質(zhì)粒注入斑馬魚胚胎中，觀察綠色熒光蛋白的表達。結(jié)果1．用改良的G6PD定量比值法檢測野

4、生型成年斑馬魚腦、眼睛、魚鰓、腸、肌肉、皮膚以及血等各組織G6PD酶活性，結(jié)果為：腦1.7307±0.1673、眼睛1.7085±0.2230、魚鰓1.7347±0.1901、腸1.7501±0.2241、肌肉1.7201±0.1573、皮膚1.7460±0.1756、血1.7012±0.1902，斑馬魚體積較小，血量較少，但本研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚的各個組織當(dāng)中同樣能夠檢測斑馬魚的酶活性。同時利用相同的方法檢測斑馬魚胚胎各時相的酶活性，包括

5、24小時、48小時、5天、15天，檢測結(jié)果如下：24小時1.7429±0.1701、48小時1.7495±0.1296、5天1.7118±0.2236、15天1.7621±0.1690。2．成功設(shè)計突變體mutant g6pd基因；3．構(gòu)建g6pd-EGFP-pCS2+、突變型mutant g6pd-EGFP-pCS2+重組質(zhì)粒；4．制備出斑馬魚g6pd基因反義mRNA探針；5．將mutant g6pd-EGFP-pCS2+重組質(zhì)粒顯微

6、注射入斑馬魚胚胎內(nèi)，在熒光顯微鏡下觀察到熒光表達情況。結(jié)論1．本研究采用改良的G6PD定量比值法在野生型斑馬魚中檢測各個組織及各個時相胚胎的G6PD酶活性，首次建立了檢測斑馬魚G6PD酶活性的技術(shù)。2．本研究所得的結(jié)果提示斑馬魚中不同組織以及不同的胚胎酶活性檢測結(jié)果無顯著差異，通過在斑馬魚中檢測不同組織及不同時相胚胎的G6PD酶活性，在斑馬魚中建立了G6PD酶活性的標(biāo)準(zhǔn)值。3．本研究采用新型模式生物斑馬魚，首次通過原位雜交觀察g6pd基