弓形蟲感染對雄性生殖損害的實驗研究.pdf

1、弓形蟲病是一種世界范圍內(nèi)廣泛存在的人獸共患性疾病，是豬、羊等經(jīng)濟動物感染性繁殖障礙的重要原因，同時也是人類生殖健康損害的感染性因素之一。弓形蟲作為專性細胞內(nèi)寄生的重要機會性致病原蟲，進入宿主機體后，能引起包括生殖系統(tǒng)在內(nèi)的多臟器損害。弓形蟲可侵入雄性生殖系統(tǒng)，如睪丸、前列腺、附睪等，引起弓形蟲性睪丸炎或雄(男)性不育。實驗動物小鼠對弓形蟲感染高度易感，常用于建立急性弓形蟲病研究的動物模型；實驗動物大鼠對弓形蟲感染則與人類、豬、羊等的感染

2、相類似，呈現(xiàn)一種亞臨床感染經(jīng)過，因此常用于人類弓形蟲病亞臨床感染的比較研究。本研究目的是將清潔級雄性實驗動物小鼠和大鼠為研究對象，建立弓形蟲感染的雄性動物模型；同時將純化的弓形蟲速殖子與正常生育男性精子一起孵育，建立弓形蟲人工感染精子的實體模型；以此研究弓形蟲感染對雄性生殖的損害作用與一些可能的作用機制，同時探討阿奇霉素對大鼠雄性生殖損害的藥物控制效果。主要研究內(nèi)容包括： 一、弓形蟲感染對清潔級實驗動物小鼠和大鼠的雄性生殖損害

3、 1、弓形蟲感染對小鼠雄性生殖機能的影響 將1×10<'3>/mL弓形蟲(RH株)速殖子懸液0.3mL腹腔接種清潔級NIH小鼠，感染4天后，將感染小鼠睪丸制成直接印片及病理切片，觀察小鼠睪丸的病理學(xué)變化及弓形蟲侵入生精細胞情況，并對弓形蟲感染小鼠的睪丸乳酸脫氫酶一同工酶、精子密度、精子活力、精子畸形數(shù)，以及與正常雌鼠交配后雌鼠的懷孕活胎數(shù)進行檢測。結(jié)果顯示：弓形蟲急性感染小鼠睪丸直接印片中可見生精細胞胞質(zhì)及核內(nèi)弓形蟲速殖子

4、，睪丸切片病理學(xué)改變?yōu)樯毎|(zhì)空泡性變。弓形蟲急性感染小鼠的睪丸乳酸脫氫酶一同工酶活性、精子密度、精子活力、以及與正常雌鼠交配后雌鼠懷孕活胎數(shù)，均比正常對照低，但精子畸形數(shù)則顯著升高(P<0.05)。提示：弓形蟲感染對雄性小鼠的生殖機能有明顯的影響。 2、弓形蟲感染對大鼠的雄性殖損害 將2×10<'5>/mL速殖子腹腔接種成年雄性SD清潔級大鼠，感染9周后，對大鼠血清性激素、精子數(shù)、精子活率、活力、精子質(zhì)量

5、、睪丸酶活性及睪丸組織的病理學(xué)進行檢測。同時將雄性弓形蟲感染大鼠與正常雌性成年SD大鼠按1:2合籠交配1周，于妊娠第21天解剖雌性大鼠，檢查雌鼠的黃體數(shù)、胎鼠的性別、體重、身長和尾長等。結(jié)果表明：弓形蟲感染9周，大鼠的睪丸和附睪的相對重量有所下降，精子數(shù)、活力、活率降低，血清性激素睪酮水平下降，睪丸組織呈明顯的形態(tài)學(xué)變化。與弓形蟲感染雄}生大鼠成功交配的雌性大鼠的受孕率和產(chǎn)仔數(shù)均顯著減少，但胎鼠的平均體重、身長、尾長和胎鼠的性別比例與對

6、照組比較無顯著性差異。提示：弓形蟲感染對大鼠雄}生生殖系統(tǒng)和雄性生育功能均有—定程度的損害。 3、弓形蟲速殖子體外對人類精子運動功能的影響 將經(jīng)CF-11純化的活弓形蟲(RH株)速殖子懸液，對10例健康生育男性手淫獲得、并經(jīng)上游優(yōu)化處理的精子進行體外感染孵育。按弓形蟲速殖子的蟲體含量分成A組(1×10<'3>/mL)、B組(1×10<'4>/mL)、C組(1×10<'5>/mL)、D組(1×10<'6>/mL)、E組(1

7、×10<'7>/mL)、F組(空白對照組)，分別孵育，并于0、1、2、4 h后取樣，應(yīng)用計算機輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)，分別檢測其精子運動的直線速度、曲線速度、平均路徑速度、頭部側(cè)擺幅度、前向性運動百分率等參數(shù)，觀察精子存活率，精子形態(tài)及凝集情況。另將1×10<'5>/mL純化的活弓形蟲速殖子懸液，在體外與15例經(jīng)上游優(yōu)化處理的生育男性精子一起孵育0、2、4、8、16、24 h后，檢測其精子運動方式參數(shù)。結(jié)果顯示：弓形蟲速殖子與精子

8、體外孵育后，其精子運動速度和前向運動百分率等隨蟲體含量增加及孵育時間的延長而下降，其他參數(shù)與對照組相比也相繼出現(xiàn)顯著性差異。1×10<'5>/mL弓形蟲速殖子在體外與精子孵育8 h后，精子運動速度顯著下降。孵育8 h、16 h后的精子運動方式為原地轉(zhuǎn)圈和鋸齒形運動，孵育24 h后，精子的運動速度小于10 μm/s，有活力精子則全是原地轉(zhuǎn)圈運動。并觀察到精子凝集和蟲體黏附現(xiàn)象。提示：弓形蟲速殖子體外可顯著降低精子存活率和抑制精子運動功能，

9、弓形蟲速殖子對精子運動速度和運動方式有明顯影響。其機制可能與弓形蟲速殖子對人類精子的黏附作用和蟲體侵入精子形成精子損傷等有關(guān)。 二、弓形蟲感染對小鼠和大鼠雄性生殖損害作用的可能機制研究 1、弓形蟲感染對小鼠睪丸組織細胞周期和生精細胞凋亡的影響 應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測弓形蟲(RH株)感染10<'3>/mL、10<'4>/mL、10<'6>/mL 3個劑量組小鼠睪丸組織細胞周期，并設(shè)生理鹽水和環(huán)磷酰胺對照組。應(yīng)用瑞．姬染

10、色和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧核苷酸原位末端標(biāo)記法對弓形蟲腹腔感染0.2mL×10<'5>/mL小鼠的睪丸生精細胞凋亡率進行檢測。結(jié)果顯示：不同劑量的弓形蟲感染均可使小鼠睪丸組織細胞各時相的細胞百分數(shù)發(fā)生變化，并隨著劑量的增加，G<,0>/C<,1>、S時相的細胞百分數(shù)明顯減少，與陰性對照組比較差異具有顯著性(P<0.05)。G<,2>/M時相的細胞百分數(shù)逐漸增多，各劑量組與陰性對照組比較差異具有顯著性(P<0.05)。弓形蟲腹腔感

11、染小鼠的睪丸生精細胞凋亡率顯著高于正常。提示：弓形蟲感染可能抑制小鼠睪丸細胞的DNA合成，可引起G<,2>期細胞阻滯，從而使細胞的有絲分裂延伸。并且弓形蟲感染可能有促進小鼠生精細胞凋亡的作用。 2、弓形蟲感染對大鼠T細胞免疫功能的動態(tài)研究 應(yīng)用流式細胞術(shù)分別檢測腹腔感染經(jīng)CF-11纖維素純化的活弓形蟲(RH株)速殖子2×10<'5>/mL懸液2 mL后第3、7、14、21、28、35、42、60 d大鼠外周血CD3<'+

12、>、CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴細胞的百分率，并應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定其外周血IFN-γ、TNF-α、IL-4等細胞因子水平。結(jié)果表日月 CD8<'+>T細胞亞群水平在感染弓形蟲后3 d、7 d、14 d、21 d時均顯著低于正常水平(P<0.05)，至感染后28 d恢復(fù)至正常。而CD4<'+>T細胞亞群水平在整個感染過程中則無顯著性變化。CD4<'+>/CD8<'+>比值升高，以感染后第14 d最為明顯；大鼠外周血中IFN-

13、γ和IL-4水平在感染后7 d開始升高(P<0.05)，至感染后60 d時仍高于正常水平，TNF-α至感染后28 d時方高于正常(P<0.05)，至感染后60d時也仍高于正常水平。結(jié)果提示：大鼠感染弓形蟲初期(急性期)可引起其T細胞亞群的分布失衡，但隨著感染時間的延長而得到修復(fù)。 3、弓形蟲感染對大鼠睪丸組織細胞凋亡的影響 腹腔感染2×10<'5>/mL活的純化弓形蟲速殖子懸液(CF-11纖維素純化)2mL于SD大鼠，建

14、立大鼠弓形蟲病模型。9周后解剖大鼠，取睪丸制成睪丸組織單細胞懸液，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測其細胞凋亡和細胞周期。結(jié)果表明：弓形蟲感染大鼠睪丸組織細胞凋亡率顯著高于正常對照組(P<0.05)。提示：弓形蟲感染可引起大鼠睪丸組織細胞發(fā)生凋亡。 三、弓形蟲感染對大鼠雄性生殖損害的藥物控制研究 通過對腹腔感染弓形蟲的雄性實驗動物大鼠模型進行藥物治療實驗，開展了阿奇霉素對弓形蟲感染大鼠雄性生殖系統(tǒng)和雄性生育力的保護作用研究，并從睪丸細胞