動物細胞培養(yǎng)技術研究概述

1、<p>　　動物細胞培養(yǎng)技術研究概述</p><p>　　[摘要] 動物細胞培養(yǎng)是生物、生物醫(yī)學研究和應用中廣泛采用的技術方法,可分為原代和傳代培養(yǎng),有貼壁、懸浮和固定化培養(yǎng)等培養(yǎng)方式。細胞生長具有特殊的生物學性質,需要無菌、恒溫和充分的營養(yǎng)環(huán)境.動物細胞培養(yǎng)技術在擁有廣闊的發(fā)展空間和光明前景的同時也面臨著諸多問題和挑戰(zhàn)。</p><p>　　[關鍵詞] 細胞培養(yǎng);微載體;中空

2、纖維;微囊法培養(yǎng)</p><p><b>　　動物細胞培養(yǎng)的發(fā)展</b></p><p>　　動物細胞體外培養(yǎng)最早可追溯到1907年,由美國生物學家Harrison在無菌條件下,以淋巴液為培養(yǎng)基成功地在試管中培養(yǎng)了蛙胚神經組織達數(shù)周,創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)法。此后,隨著抗生素、培養(yǎng)基、培養(yǎng)裝置以及工藝方法的不斷改進,動物細胞培養(yǎng)(Animal cell culture )

3、的研究和應用逐步增多和深入,發(fā)展至今已成為在生物、醫(yī)學研究和應用中廣泛采用的技術方法。其發(fā)展簡史見下表：</p><p>　　動物細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展[1]</p><p>　　動物細胞培養(yǎng)的概念及生物學特性</p><p>　　動物細胞培養(yǎng)的基本概念</p><p>　　細胞培養(yǎng)是指從體內組織取出組織細胞并模擬體其內生存環(huán)境,在無菌、適當溫度

4、及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下,使其生長繁殖并維持結構和功能的一種培養(yǎng)技術。</p><p>　　從體內取出細胞首次培養(yǎng)即為原代培養(yǎng)(Primary Culture),這是細胞培養(yǎng)的最初和必經階段.當原代培養(yǎng)細胞生長到一定時期,受到群體環(huán)境限制,就需要轉移到另一容器才能繼續(xù)生長,稱為傳代或繼代培養(yǎng)(Sub culture)。根據(jù)原代培物性狀的一致性與否,傳代成功后稱為細胞系(Cell line)或細胞株(Cell St

5、rain)。這些細胞一般可順利傳40～50代次,并保持染色體二倍體數(shù)量和接觸抑制,傳至50代左右時則出現(xiàn)生長停滯,大部分衰老死亡,此類稱為有限細胞系/株;在細胞傳代的過程中,有些因發(fā)生遺傳突變獲得了持久性增殖能力的細胞稱為無限細胞系/株[2]。</p><p>　　動物細胞培養(yǎng)的生物學特性</p><p>　　動物細胞無細胞壁,機械強度低,對剪切力敏感,適應環(huán)境能力差;倍增時間長,生長緩慢

6、,易受微生物污染;對生長環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境要求苛刻。</p><p>　　細胞生命周期性變化[3]</p><p>　　體外培養(yǎng)的細胞從適應環(huán)境、旺盛生長到由于自身和環(huán)境限制緩慢或停滯生長經歷一個周期變化。</p><p>　　（1）、潛伏期(Latent phase)</p><p>　　細胞從接種到適應新環(huán)境生長繁殖的一段時間,此間細胞胞質回

7、縮,代謝緩慢.</p><p>　　（2）、指數(shù)生長期(Logarithmic phase)</p><p>　　指數(shù)生長期是細胞活力最好的時期,細胞增殖旺盛.在接種細胞數(shù)量適宜的情況下,指數(shù)生長期持續(xù)3～5ｄ后,隨細胞數(shù)量不斷增多,生長空間日趨減少,營養(yǎng)環(huán)境惡化,呈現(xiàn)接觸抑制(Contact inhibition)。惡性細胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細胞代謝產物的影響而發(fā)生密度抑制(Dens

8、ity inhibition)。</p><p>　?。?）、穩(wěn)定期(Stagnate phase)</p><p>　　細胞數(shù)量達到飽和密度后,細胞與營養(yǎng)液的交換面積減少,代謝產物積累,ｐＨ值下降,細胞停止增殖,進入停滯期.營養(yǎng)環(huán)境繼續(xù)惡化后,細胞受損直至死亡。</p><p>　　細胞培養(yǎng)環(huán)境和生長條件</p><p>　　（1）、無菌無

9、毒環(huán)境</p><p>　　無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件.在體外培養(yǎng)的細胞,由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物質污染,或者自身代謝物質積累,就可能會導致細胞中毒死亡。因此,在體外培養(yǎng)細胞時,應及時清除細胞代謝產物,以保持細胞生存環(huán)境無菌無毒。</p><p><b>　　（2）、恒溫</b></p>

10、<p>　　要維持培養(yǎng)的細胞旺盛生長,必須有恒定適宜的溫度.偏離適當?shù)臏囟确秶?細胞會受到損傷,影響正常代謝甚至死亡。</p><p><b>　　（3）、氣體環(huán)境</b></p><p>　　氣體主要是 O2和 CO2，O2可以給細胞提供能量，而 CO2不僅是細胞增殖所需的物質，也是其自身的代謝產物，此外，CO2還有著調節(jié)培養(yǎng)基 pH 的作用。</

11、p><p><b>　?。?）、緩沖環(huán)境</b></p><p>　　緩沖環(huán)境的作用是為細胞提供一個酸堿度在培養(yǎng)細胞生理范圍內的培養(yǎng)液，提供水分和無機鹽，維持細胞的正常代謝。</p><p><b>　?。?）、培養(yǎng)基</b></p><p>　　培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)中供給細胞營養(yǎng)和促進增殖的基礎物質，分為

12、天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩種，它是細胞生長繁殖的直接環(huán)境，天然培養(yǎng)基從動物體液或組織中分離提取,如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等;合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分,模擬合成、配制的培養(yǎng)</p><p>　　基.它包含細胞生長的無機鹽、氨基酸、維生素、糖類等基本物質和一些特殊的添加成分結合適量添加血清,廣泛應用于動物細胞培養(yǎng)。</p><p><b>　　動物細胞培養(yǎng)的方式<

13、/b></p><p>　　貼壁培養(yǎng)(Mono layer culture)</p><p>　　貼壁培養(yǎng)主要適用于貼壁依賴性細胞.一般源于實體組織的細胞需要相互依賴,需貼附于不起化學作用的物質(玻璃或塑料等無活性物質)的表面生長、生存和維持,并最終在附著面生長至單層,鋪滿平面時便會發(fā)生接觸抑制。</p><p>　　懸浮培養(yǎng)(Suspension cultu

14、re)</p><p>　　懸浮適應細胞、源于循環(huán)系統(tǒng)的細胞及腫瘤細胞等非貼壁依賴性細胞無需支撐面,細胞或細胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖.懸浮培養(yǎng)是大規(guī)模細胞培養(yǎng)的理想方式。</p><p>　　固定化培養(yǎng)(Immobilizing culture)</p><p>　　固定化培養(yǎng)是一種包埋培養(yǎng)方式,適用于貼壁依賴性細胞和非貼壁依賴性細胞.它具有剪切力低、傳遞效果

15、好和抗污染能力強、細胞生長密度高、產物易于收集和分離純化等特點。</p><p>　　微載體培養(yǎng)(Micro-carrier culture)</p><p>　　傳統(tǒng)的貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)通過靜止或轉瓶等培養(yǎng)來獲得,操作繁復,且耗費空間及人力。1967年,Van Wezel首次提出了“微載體”培養(yǎng)系統(tǒng),使貼壁依賴型細胞貼附在微載體上懸浮于液體培養(yǎng)基中生長,兼具平板培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢,增

16、加培養(yǎng)面積同時獲得均一的環(huán)境培養(yǎng)條件(溫度、PH值、CO2濃度、葡萄糖濃度等),便于控制放大獲得高密度培養(yǎng)細胞和優(yōu)化下游控制。</p><p>　　中空纖維培養(yǎng)(Hollow fib res culture )</p><p>　　1972年,Richard Knazek首次報道該技術[4]。該技術是模擬細胞在體內生長的三維狀態(tài),利用一種人工的“毛細管”即中空纖維給培養(yǎng)的細胞提供物質代謝條

17、件而建立的一種體外培養(yǎng)系統(tǒng)。中空纖維表面具有海綿狀多孔結構,既能使水分子、營養(yǎng)物質和氣體透過,也能使細胞在上面貼附生長.該技術的特點是:細胞培養(yǎng)環(huán)境溫和,培養(yǎng)細胞密度較高,產品較容易分離純化[5]。</p><p>　　微囊法培養(yǎng)[6]（Micro-encapsulation culture ）</p><p>　　微囊化培養(yǎng)技術是20世紀70年代由Ｌｉｎ和Ｓｕｎ創(chuàng)建的一種大規(guī)模培養(yǎng)技術[

18、4].其要點是:在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細胞、生物活性物質及生長介質共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內進行培養(yǎng).微囊化培養(yǎng)有一些突出的優(yōu)點。首先,細胞能生長和維持在小體積的培養(yǎng)液中,這使培養(yǎng)液中的分泌產物變濃,簡化了下游加工。其次,培養(yǎng)液易于迅速改變,且無分離細胞與培養(yǎng)液的困難。最后,微囊固定化細胞較少暴露于物理損傷環(huán)境。這種技術最早由Lima[7]等人提出,Da-mon Bio tech公司[8]最先實現(xiàn)工業(yè)化。他們

19、用一層非常薄的聚賴氨酸殼把雜交瘤細胞囊括起來,形成200μm直徑的小球,從培養(yǎng)開始大約10天,雜交瘤細胞可長滿微囊。據(jù)報道,微囊中單抗?jié)舛群芨?可達2. 5g /L,且無其它雜蛋白,容易獲得高純度單抗。目前,微囊工藝已用于生產以克計的單克隆抗體。高表達有工業(yè)價值蛋白質的重組細胞近年來亦更多地用微囊化培養(yǎng)[9]。</p><p>　　動物細胞培養(yǎng)存在的問題</p><p>　　近一個世紀以來

20、，人類對動物細胞培養(yǎng)技術的大量研究和開發(fā)，并取得了一定的進展。但目前的技術水平還遠不能滿足細胞生物制品開發(fā)和生產的要求。目前存在的問題主要有：</p><p>　　各類動物細胞培養(yǎng)技術水平發(fā)展不均衡，特別是低等動物類細胞培養(yǎng)的技術和方法尚不成熟。</p><p>　　動物細胞培養(yǎng)效率較低，其成活率和利用率也不理想。</p><p>　　在大規(guī)模、長時間的人工培養(yǎng)過程

21、中，細胞群體的生理機能受到影響，如分泌和代謝能力的喪失或代謝產物的活性降低等。</p><p>　　動物細胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)設備以及培養(yǎng)用微載體等耗材昂貴，造成研究和開發(fā)的成本增加，這也成為限制動物細胞培養(yǎng)工程在中國大規(guī)模的開展的重要原因之一[10]。</p><p><b>　　前景與展望</b></p><p>　　在目前和今后若干年內,在可

22、表達復雜真核基因的微生物系統(tǒng)及用作生物反應器的轉基因動物系統(tǒng)尚未成功開發(fā)之前,動物細胞作為一種日趨成熟的表達系統(tǒng),會愈來愈受到研究人員和生產人員的重視,并將成為基因工程和細胞工程中十分活躍的領域,眾多的產物必須依靠這種系統(tǒng)進行表達與生產。展望未來,動物細胞培養(yǎng)工程發(fā)展的總方向是:</p><p>　　大型化、自動化、精巧化、低成本、高細胞密度、高目的產品產量。具體地說,就是開發(fā)能高密度生長、能分泌大量目標產品的細

23、胞系。這些細胞系應具有放大的目的基因或具有選擇性標記,從而可以保持對特定產物的表達。</p><p>　　開發(fā)細胞生長性能優(yōu)良、解離細胞容易,并能重復使用的新型廉價微載體。</p><p>　　研制更大規(guī)模的高無菌條件的生物反應器和剪切力小、混合性能良好的新型攪拌系統(tǒng)。</p><p>　　將其它領域(諸如自動控制、傳感器)的高精尖技術移植于細胞培養(yǎng)工程領域,以提高

24、大規(guī)模培養(yǎng)的自動化、精巧化水平,并能更經濟地設計流加或灌注培養(yǎng)過程。</p><p>　　由于某些生長因子基因在導入哺乳動物細胞后,其表達產物有可能使細胞脫離血清生長,這一途徑對于今后的哺乳動物細胞基因工程有很大吸引力,并將推動無血清培養(yǎng)基的開發(fā)進入一個嶄新階段。</p><p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　[1] 趙佼

25、，譚文松，俞俊棠.大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)技術研究進展.華東理工大學學報 1997-04</p><p>　　[2] 孔永，秦秀云.動物細胞培養(yǎng)技術研究進展.重慶文理學院學報(自然科學版) 2007年8 月第26卷 </p><p><b>　　第4期</b></p><p>　　[3] 王捷,等.動物細胞培養(yǎng)技術與應用[Ｍ].北京:化學工業(yè)出版社,

26、2004:1-9</p><p>　　[4] 石凱,熊曉輝,許建生.固定化動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術研究進展[Ｊ].化工進展，2002,21(8):556-559. </p><p>　　[5] Mary a IC ,Julio AL,Ricardo JG.Solving design equations for a hollow fiber biiore </p>&

27、lt;p>　　actor with arbitrary kinetics [J].Chemical Engineering Journal2001(84):445-461 </p><p>　　[6] 趙佼，譚文松，俞俊棠.大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)技術研究進展.華東理工大學學報 1997-04</p><p>　　[7] Lima F,M loss R D.M encapsulation

28、of living cells and tissues. J P harm Sci, 1981,70</p><p>　　[8] Bellicose E G.M encapsulation technology for large-scale antibody production. </p><p>　　Bio/Technology, 1986,4(2): 114～117</p&g

29、t;<p>　　[9] 朱冬發(fā),李士云,谷鑫松,等.HPLC監(jiān)測微囊化細胞培養(yǎng)中乳酸和丙酮酸的變化.生物化學與生物物理</p><p>　　學報, 1994,26(5): 571～575</p><p>　　[10] 侯雪芹，林小樺，李薇.動物細胞培養(yǎng)技術研究的現(xiàn)狀與思考.遼寧中醫(yī)藥大學學報.第12卷 </p><p>　　第11期 2010 年 1