柑橘全爪螨Panonychus citri(McGregor)對熱脅迫的響應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、柑橘全爪螨Panonychus citri(McGregor)屬蛛形綱Arachnida、蜱螨目Acarina、葉螨科Tetranychidae、全爪螨屬Panonychus。該螨是一種世界性害螨,寄主廣泛,大多以刺吸方式為害葉片、嫩梢、果皮,尤以葉片受害最重,嚴(yán)重時導(dǎo)致落葉、落果,影響樹勢和產(chǎn)量。柑橘是中國南方最主要的水果之一,栽培品種多,出口數(shù)量大,是重要的經(jīng)濟(jì)作物。由于采取清耕法的集約化栽培,果園植物單一,加之單一依賴化學(xué)防治,用

2、藥不當(dāng),大量殺滅果園害螨天敵,破壞橘園的生態(tài)平衡,且該螨世代周期短,抗藥性增加迅速,使柑橘全爪螨成為柑橘栽培中頭等重要的害蟲(螨)之一,是柑橘園常發(fā)性、災(zāi)害性的有害生物。柑橘全爪螨每年發(fā)生多代,一年有2個高峰期(春季至初夏和秋季)和2個低谷期(夏季和冬季)。已有研究表明,柑橘全爪螨適宜的溫度范圍為20-30℃,高于35℃不利于其生殖發(fā)育,40℃以上死亡率高。在中國柑橘主產(chǎn)區(qū)夏季氣溫常高達(dá)35℃以上,甚至40℃,冬季溫度常低至0℃以下。極

3、端溫度的存在,必將對柑橘全爪螨造成熱脅迫,柑橘全爪螨在長期的進(jìn)化過程中形成了一系列響應(yīng)機(jī)制應(yīng)對熱脅迫。熱激蛋白(Heat shockproteins,Hsps)是當(dāng)今生物適應(yīng)逆境脅迫研究的熱點,Hsps是廣泛存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的蛋白質(zhì),亞致死熱脅迫能夠誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生熟激Hsps,它們能夠提高生物的熱忍耐力。此外熱脅迫常會引起過氧化反應(yīng),有機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)在應(yīng)對氧化脅迫方面發(fā)揮著重要作用。物質(zhì)和能量是守恒的,在有機(jī)體為應(yīng)對脅迫而合成

4、抗脅迫物質(zhì)的同時,會減少其他有機(jī)物的合成,表現(xiàn)為縮短壽命、生殖力下降等,導(dǎo)致種群數(shù)量的變化。
　　 本學(xué)位論文以柑橘全爪螨為研究對象,瞄準(zhǔn)生物適應(yīng)逆境脅迫的機(jī)制這一國際研究熱點,在生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)上,開展了柑橘全爪螨Hsps基因的克隆、分子生物學(xué)特性、轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式及異源表達(dá)研究,并結(jié)合抗氧化系統(tǒng),綜合分析柑橘全爪螨對熱脅迫的響應(yīng)機(jī)制,旨在理解柑橘全爪螨Hsps的分子伴侶功能及其與抗熱脅迫的關(guān)系,了解柑橘全爪螨抗氧化系統(tǒng)在抵御

5、熱脅迫方面發(fā)揮的重要作用,揭示柑橘全爪螨乃至其他昆蟲(螨)抗逆機(jī)制,為掌握昆蟲(螨)種群數(shù)量的季節(jié)動態(tài)提供理論依據(jù)。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1高溫對柑橘全爪螨存活及生殖的影響
　　 在室內(nèi)設(shè)置了32、35、38及41℃4個溫度梯度,以25℃為對照,分別短時脅迫柑橘全爪螨卵及雌成螨,觀察高溫對柑橘全爪螨存活及生殖的影響。研究結(jié)果表明,隨著脅迫溫度升高,卵孵化率下降,當(dāng)脅迫溫度達(dá)35℃及以上時,各處理的卵孵化率顯著低

6、于對照。25℃時,柑橘全爪螨每雌平均總產(chǎn)卵量達(dá)53.7粒,在上述高溫脅迫1 h,柑橘全爪螨的單雌總產(chǎn)卵量呈顯著下降趨勢,且隨著脅迫時間的延長,產(chǎn)卵量繼續(xù)下降。環(huán)境溫度為25℃時,柑橘全爪螨雌成螨的平均壽命為12.1天。高溫脅迫1 h,柑橘全爪螨壽命總體呈縮短趨勢,溫度上升到35℃以上,差異達(dá)顯著水平,且隨脅迫時間延長,縮短程度加劇。高溫脅迫對柑橘全爪螨雌成螨的特定年齡存活率(lx)和特定年齡生殖力(mx)均存在不利影響,且隨脅迫溫度的升

7、高及時間的延長影響程度增大。
　　 2柑橘全爪螨對熱脅迫的抗氧化反應(yīng)
　　 熱脅迫是導(dǎo)致柑橘全爪螨發(fā)生氧化脅迫的因素之一。研究表明,熱激或冷激能夠干擾機(jī)體氧化還原反應(yīng)平衡,從而導(dǎo)致氧化脅迫。柑橘全爪螨雌成螨在0、5、10、15、32、35、38及41℃條件下分別脅迫1 h、2 h及3 h,以25℃為對照,測定柑橘全爪螨的抗氧化反應(yīng)。結(jié)果表明,柑橘全爪螨遭受熱脅迫后,其體內(nèi)CAT和POD活性以及T-AOC在清除ROS的過程

8、中,發(fā)揮的作用有限；而SOD在冷激條件下出現(xiàn)先上升后下降的動態(tài)趨勢,暗示低溫誘導(dǎo)SOD的抗氧化反應(yīng)。GSTs的抗氧化反應(yīng)無論在熱激還是冷激條件下,均出現(xiàn)先上升然后下降的動態(tài)趨勢。由此可見,SOD和GSTs在柑橘全爪螨抗氧化脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。作為脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)之一的MDA,其含量從時間動態(tài)上看能夠維持在正常水平。綜合分析表明,柑橘全爪螨能有效抵御熱脅迫造成的氧化脅迫。
　　 3柑橘全爪螨RT-qPCR內(nèi)參基因的篩選

9、>　　 運用geNorm和NormFinder兩種軟件,對柑橘全爪螨已有的7個看家基因Pc5.8SrRNA、PcActin、PeEf-1α、PeGapdh、PcRpII、PcSdha及Pca-Tubulin在不同發(fā)育階段和熱脅迫下的穩(wěn)定性進(jìn)行了評價。發(fā)育階段選取了卵、幼螨、若螨、雄成螨和雌成螨共5個處理,熱脅迫分為冷激(0、5和10℃)和熱激(35、38和41℃),處理時間均為1 h,以25℃為對照。分析結(jié)果表明,在柑橘全爪螨不同發(fā)育

10、階段及熱脅迫1 h條件下,Pc5.8SrRNA、PcActin及PcSdha的穩(wěn)定性均較差。在不同發(fā)育階段穩(wěn)定性較好的是PcRpII；低溫脅迫1 h穩(wěn)定性較好的是PcGapdh和Pcα-Tubulin:高溫脅迫1 h穩(wěn)定性較好的是PcRpII。若使用多內(nèi)參基因評價體系,不同發(fā)育階段最適內(nèi)參基因數(shù)目是2,建議選用PcEf-1α+PcRpII組合；低溫脅迫下最適內(nèi)參基因數(shù)目也是2,建議選用PcGapdh+Pcα-Tubulin組合；高溫脅迫

11、下,在現(xiàn)有內(nèi)參基因的情況下,較適內(nèi)參基因數(shù)目是3,建議選用PcEf-1α-PcGapdh+PcRpII組合。本研究采用單個內(nèi)參基因評價體系,綜合上述兩種軟件評價結(jié)果,柑橘全爪螨不同發(fā)育階段及雌成螨高溫脅迫下均選用PcRpII作為內(nèi)參基因；低溫脅迫下,選用Pcα-Tubulin作為內(nèi)參基因。
　　 4柑橘全爪螨Hsp90和Hsp70家族基因克隆和序列分析
　　 4.1 Hsp90
　　 利用RT-PCR結(jié)合RACE

12、技術(shù),從柑橘全爪螨體內(nèi)成功克隆獲得了1個Hsp90家族基因PcHsp90的cDNA全長序列,GenBank登錄號為GQ495086。該基因cDNA全長為2,763 bp,開放閱讀框長度為2,193 bp,編碼730氨基酸殘基。
　　 進(jìn)一步利用Protparam和Seanprosite等生物信息學(xué)軟件分析了推導(dǎo)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、保守基序等序列特征。PcHsp90基因編碼的氨基酸序列具有5個典型的Hsp90家族特征基序(motif

13、),它們分別是:NKEIFLRELISNSSDALDKIR、LGTIARS、IGQFGVGFYSAYLVAD、IKLYVRRVFI和GVVDSEDLPLNISRE,且具有細(xì)胞質(zhì)Hsp90 C-端標(biāo)志性基序“MEEVD”,明確了其在細(xì)胞中的定位。采用軟件MEGA4.1用鄰接法(Neighbor-joining method,N-J法),從GenBank選取12個不同物種的Hsp90與PcHsp90編碼的氨基酸共同構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,其中Pc

14、Hsp90與朱砂葉螨Hsp90親緣關(guān)系最近,最先聚為一支。然后再與肩突硬蜱Hsp90相聚,而與昆蟲綱的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。應(yīng)用蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)同源模擬工具SWISS-MODEL,構(gòu)建了PcHsp90編碼的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型,可清楚地看到3個結(jié)構(gòu)域:NBD(Nuleotide binding domain)、MD(Middle domain)和CTD(C-terminus domain)。
　　 4.2 HspTOs
　　 同樣,

15、從柑橘全爪螨體內(nèi)成功克隆獲得了3個Hsp70家族基因PcHsp70—1、PcHsp70-2和PcHsp70-3的cDNA全長序列,GenBank登錄號分別為:GQ495083、GQ495084和GQ495085。PcHsp70-1基因cDNA全長為2,586 bp,開放閱讀框長度為1,977 bp,編碼658個氨基酸殘基；PcHsp70-2基因cDNA全長為2,405 bp,開放閱讀框為1,968 bp,編碼655個氨基酸殘基；PcHs

16、p70-3基因cDNA全長為2,300 bp,開放閱讀框長度為2,028 bp,編碼675個氨基酸殘基。
　　 進(jìn)一步利用Protparam和Seanprosite等生物信息學(xué)軟件分析了推導(dǎo)的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、保守基序等序列特征。上述3個基因編碼的氨基酸序列均具有Hsp70家族3個典型的特征基序(motif)。PcHsp70-1和PcHsp70-2編碼的氨基酸末端序列為“EEVD”,是細(xì)胞質(zhì)Hsp70所具有的特征基序,因此二者為細(xì)

17、胞質(zhì)型Hsp70。PcHsp70-3編碼的氨基酸末端序列為“KDEL”,為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的典型特征,判定其為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型Hsp70。柑橘全爪螨的3個Hsp70家族基因推導(dǎo)的氨基酸序列之間的相似性如下:PcHsp70-1和PcHsp70-2之間為87％；PcHsp70-1和PcHsp70-3為64.7％:PcHsp70-2和PcHsp70-3為65.8％。從GenBank中下載了來自其他物種的27個Hsp70氨基酸序列與本研究中的3個Hsp70

18、基因推導(dǎo)的氨基酸序列共同構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。該系統(tǒng)發(fā)育樹分為3支,分別是來自細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的Hsp70。與序列分析結(jié)果一致,PcHsp70-1和PcHsp70-2首先與其它物種的細(xì)胞質(zhì)型Hsp70聚為一支,PcHsp70-3與其它物種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型Hsp70聚為一支。應(yīng)用蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)同源模擬工具SWISS-MODEL,分別構(gòu)建了PcHsp70-1、PcHsp70-2和.PcHsp70-3編碼的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型,它們均含有2個結(jié)構(gòu)域:

19、NBD(Nucleotide binding domain)和SBD(Substrate binding domain)。
　　 5柑橘全爪螨Hsp90和Hsp70基因的mRNA表達(dá)模式解析
　　 采用RT-qPCR技術(shù),以PcRpII做為內(nèi)參基因,分別測定了PcHsp90、PcHsp70-1、PcHsp70-2和PcHsp70-3四個基因在柑橘全爪螨卵、幼螨、若螨、雄成螨及雌成螨等幾個發(fā)育階段的mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)

20、果顯示,PcHsp90基因在卵、若螨和成螨階段均大量表達(dá),PcHsp70-1和PcHsp70-3基因在各發(fā)育階段的表達(dá)量變化不大,而PcHsp70-2基因在各階段的表達(dá)量變化非常明顯。說明PcHsp90基因與維持基本生命活動和生長發(fā)育相關(guān),而PcHsp70-1和.PcHsp70-3基因可能是維持基本的生命活動所必須的,PcHsp70-2基因可能與柑橘全爪螨的生長發(fā)育密切相關(guān)。
　　 以Pca-Tubulin做為內(nèi)參基因,分別測定

21、了柑橘全爪螨Hsp90家族和Hsp70家族的上述4個基因在低溫(0、5和10℃)脅迫1 h后mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果表明,4個基因在低溫脅迫下mRNA表達(dá)量均呈下降趨勢。說明低溫短時脅迫可能誘導(dǎo)其它Hsps和物質(zhì)表達(dá),從而抑制這4個基因的mRNA表達(dá)水平。
　　 以PcRpII做為內(nèi)參基因,分別測定了上述4個基因在高溫(35、38和41℃)脅迫1 h后mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果表明,高溫脅迫下,4個基因的表達(dá)量隨溫度升高都呈現(xiàn)

22、上調(diào)趨勢,其中PcHsp90和PcHsp70的表達(dá)量與對照相比變化顯著,如41℃處理1 h,PcHsp90基因mRNA表達(dá)量為對照的6.75倍,PcHsp70-2基因表達(dá)量為對照的28.37倍。說明二者在抵御高溫脅迫方面發(fā)揮著重要作用。
　　 綜上所述,PcHsp70-1和PcHsp70-3基因主要與維持生命活動有關(guān),與熱脅迫關(guān)系不密切:PcHsp90基因參與基本生命活動,并在抵御高溫脅迫方面具有重要作用；PcHsp70-2基因

23、與生長發(fā)育密切相關(guān),并在抵御高溫脅迫方面發(fā)揮著重要作用。低溫短時脅迫可能誘導(dǎo)其它Hsps或物質(zhì)表達(dá),從而抑制這4個基因的表達(dá)。
　　 6柑橘全爪螨Hsp70基因異源表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 利用BamHI和NotI的雙酶切以及DNA重組技術(shù)成功構(gòu)建了柑橘全爪螨PcHsp70-1、PcHsp70-2和PcHsp70-3基因基于pET28a(+)的原核表達(dá)載體,這為進(jìn)一步深入研究Hsp70蛋白質(zhì)特性奠定了基礎(chǔ)。
　　 綜

24、上所述,本研究明確了高溫短時脅迫對柑橘全爪螨存活和生殖的影響,為生化及分子水平的研究奠定了生物學(xué)基礎(chǔ),從抗氧化角度研究了熱脅迫誘導(dǎo)柑橘全爪螨的抗氧化反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上,深入分子機(jī)制研究,克隆獲得了柑橘全爪螨Hsp90和Hsp70家族新基因4個,為準(zhǔn)確解析這4個基因的mRNA水平表達(dá)模式,運用目前常用的兩種軟件geNorm和NormFinder軟件評價7個候選內(nèi)參基因,最終確定了柑橘全爪螨不同發(fā)育階段和熱脅迫下的最適內(nèi)參基因。采用RT-qP