柑橘全爪螨幾丁質(zhì)合成與代謝途徑重要基因的研究.pdf

1、幾丁質(zhì)在昆蟲（螨）生長發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。昆蟲（螨）在生長發(fā)育過程中依賴于幾丁質(zhì)合成和代謝的調(diào)控。幾丁質(zhì)廣泛存在于原生動物、線蟲、昆蟲（螨）和甲殼類動物體內(nèi)，由于在植物和哺乳動物體內(nèi)沒有幾丁質(zhì)，因此幾丁質(zhì)的合成與代謝成為目前昆蟲（螨）生長發(fā)育研究的熱點。柑橘全爪螨Panonychus citri(McGregor)是一種世界性的害螨，寄主范圍廣，可為害多達112種植物。在我國，該螨發(fā)生面積廣、為害時間長、種群密度高，是我國柑橘產(chǎn)區(qū)

2、最為重要的害螨。柑橘全爪螨以刺吸方式取食嫩梢、葉片、果皮，造成落葉落果，嚴重影響品質(zhì)和產(chǎn)量。由于采取集約化栽培管理模式，橘園植物單一，加之過度依賴于化學防治，大量殺死橘園害螨天敵，破壞橘園生態(tài)系統(tǒng)平衡，導致其抗性發(fā)展迅速。因此，尋找新的途徑取代傳統(tǒng)農(nóng)藥防治柑橘全爪螨變得尤為重要。本學位論文圍繞柑橘全爪螨生長發(fā)育過程中幾丁質(zhì)生物合成與代謝調(diào)控這一科學問題，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，圍繞幾丁質(zhì)合成與代謝途徑中關(guān)鍵基因的分子特性及功能，開展了較為系

3、統(tǒng)的研究工作。主要研究結(jié)果如下:
　　1、柑橘全爪螨田間種群抗藥性監(jiān)測
　　利用改進后的葉碟浸漬法，對采自四川、重慶共8個地理種群（室內(nèi)敏感品系、北碚、長壽、萬州、奉節(jié)、武隆、安岳和瀘州）的柑橘全爪螨對5種殺螨劑（阿維菌素、噠螨靈、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯和丁氟螨酯）的抗性水平進行了監(jiān)測。就殺螨活性而言，5種殺螨劑中噠螨靈的殺螨活性最強，8個地理種群對其表現(xiàn)最為敏感;丁氟螨酯、阿維菌素和甲氰菊酯的殺螨活性次之，聯(lián)苯菊酯的殺螨活性最

4、差。5種殺螨劑殺螨活性由高到低依次為:噠螨靈、丁氟螨酯、阿維菌素、甲氰菊酯和聯(lián)苯菊酯。
　　2、柑橘全爪螨幾丁質(zhì)合成酶1基因克隆及表達特性分析
　　基于柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，克隆獲得柑橘全爪螨幾丁質(zhì)合成酶1(CHS1)基因的cDNA全長序列，GenBank登錄號為KF241748。利用基因組DNA作為模板擴增發(fā)現(xiàn)該基因不具有選擇性剪切現(xiàn)象，僅含有1個可變外顯子PcCHS1b。該基因開放閱讀

5、框4，305bp，編碼1，535個氨基酸殘基。與二斑葉螨、轉(zhuǎn)基因捕食螨以及昆蟲幾丁質(zhì)合成酶進行氨基酸序列比對，結(jié)果表明PcCHS1含有非常保守的特征位點:N端跨膜結(jié)構(gòu)域，含有11個跨膜超螺旋;中心催化結(jié)構(gòu)域，包括“EDR”和“QRRW”兩個幾丁質(zhì)合成酶特征序列;C端跨膜結(jié)構(gòu)域，含有1個“TWGTR”特征基序及7個跨膜超螺旋，其中有5個超螺旋緊隨中間的催化結(jié)構(gòu)域。通過構(gòu)建幾丁質(zhì)合成酶1基因系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)PcCHS1與二斑葉螨CHS1聚為一

6、支，說明柑橘全爪螨CHS1同二斑葉螨CHS1在生理功能、進化關(guān)系上具有相似性。在柑橘全爪螨生長發(fā)育過程中，PcCHS1在卵期表達量最高，其次為幼螨和若螨期，在成螨期表達量最低。使用不同濃度的除蟲脲(DFB)處理柑橘全爪螨幼螨6h后，PcCHS1基因的表達量顯著高于對照組，推測可能是由于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)合成途徑受阻后CHS1基因補償性調(diào)節(jié)所造成的。
　　通過微量酶標板法對柑橘全爪螨不同發(fā)育階段、除蟲脲藥劑處理下幾丁質(zhì)含量進行測定，結(jié)

7、果顯示，柑橘全爪螨幾丁質(zhì)含量隨著生長發(fā)育呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其中幾丁質(zhì)含量在幼螨期最高，隨后逐漸降低，至成螨期幾丁質(zhì)含量降到最低。對不同濃度DFB處理6h后幼螨幾丁質(zhì)含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度藥劑處理后幼螨幾丁質(zhì)含量均顯著降低，其中經(jīng)LC10藥劑處理后幼螨幾丁質(zhì)含量僅為對照的一半，而經(jīng)LC30和LC50濃度藥劑處理后相對于LC10濃度處理雖有所上升，但仍顯著低于對照害螨幾丁質(zhì)的含量。
　　3、柑橘全爪螨幾丁質(zhì)酶基因克隆、表達

8、特性及功能分析
　　克隆獲得了柑橘全爪螨3個幾丁質(zhì)酶基因cDNA全長序列，分別命名為PcCht1、PcCht2和PcCht4，GenBank登錄號分別為KJ528304、KP319018和KJ528305。PcCht1開放閱讀框1，695 bp，編碼564個氨基酸殘基。PcCht1基因組序列與cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)二者序列一致，不包含有內(nèi)含子，僅由一個外顯子組成。PcCht2開放閱讀框1，935 bp，編碼644個氨基酸殘基。PcC

9、ht4開放閱讀框1，587bp，編碼528個氨基酸殘基?；蚪M測序發(fā)現(xiàn)，PcCht4基因組序列(KJ609684)含有8個外顯子和7個內(nèi)含子，且7個內(nèi)含子均在保守區(qū)域內(nèi)，均具有GT-AG特征序列。預測PcCht1、PcCht2和PcCht4蛋白質(zhì)分子量分別為62.7 kDa、70.7 kDa和59.9 kDa，等電點分別為5.6、8.5和6.0。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)這3個基因分別與二斑葉螨TuCht1、TuCht2和TuCht4聚為一支。

10、
　　RT-qPCR結(jié)果分析表明，PcCht1、PcCht2和PcCht4的表達量在卵至幼螨階段顯著上升，在幼螨期達到最高，可能與幾丁質(zhì)酶主要在柑橘全爪螨生長發(fā)育過程中對于幼螨蛻皮發(fā)揮重要作用有關(guān)。DFB能不同程度誘導3個幾丁質(zhì)酶基因表達上調(diào)，并具有一定的濃度效應。成功構(gòu)建柑橘全爪螨人工飼喂RNAi研究技術(shù)體系，對柑橘全爪螨的幼螨飼喂人工合成的PcCht1和PcCht4基因的dsRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對PcCht1的沉默效率最高，達到5

11、5％，且能觀察到一定的異常表型，其死亡率和48 h后蛻皮率分別為60.9％和10.9％，而對PcCht4的RNAi沉默效率僅為10.9％，且未觀察到表型異?，F(xiàn)象。
　　綜上所述，本研究運用改進后的葉碟浸漬法對采自四川、重慶8個地理種群柑橘全爪螨田間種群抗藥性水平進行了監(jiān)測;基于柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，克隆獲得了柑橘全爪螨4個幾丁質(zhì)合成與代謝途徑中關(guān)鍵基因的cDNA全長序列，并進行了生物信息學分析;運用RT-qPCR技術(shù)系統(tǒng)解析了這