豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及豬細(xì)環(huán)病毒感染對(duì)其疫苗免疫的影響.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（藍(lán)耳?。?porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種高度接觸性傳染病，該病以母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬呼吸困難、敗血癥、高死亡率等為主要特征。2006年春夏之交，我國中東部地區(qū)爆發(fā)豬的“無名高熱病”，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)國家相關(guān)部門調(diào)查研究證實(shí)，其主要病原之一是豬繁殖與呼吸綜合征病

2、毒變異株。豬細(xì)環(huán)病毒(Torque teno sus vires，TTSuVs)是新發(fā)現(xiàn)病毒，目前豬體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)了TTSuV1和TTSuV2兩種病毒，廣泛存在于家豬、野豬。我國各地豬病多發(fā)，混合感染嚴(yán)重，豬細(xì)環(huán)病毒也是可能的病原。本研究開展了PRRSV的分子流行病學(xué)調(diào)查，并研究了TTSuV1自然感染對(duì)PRRSV疫苗免疫的影響。
　　 1、華東地區(qū)PRRSV分子流行病學(xué)調(diào)查
　　 為了解華東地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRR

3、SV)分子流行病學(xué)特征，運(yùn)用RT-PCR方法對(duì)來自江蘇、浙江、安徽、山東、上海、福建等6省市2006-2010年間的1509份臨床發(fā)病豬和927份臨床健康豬病料進(jìn)行了PRRSV檢測(cè)，并從每個(gè)省市PRRSV陽性樣品中任選6株變異株和3株經(jīng)典株進(jìn)行了NSP2和ORF5的基因測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：臨床發(fā)病豬中變異株陽性樣品984份(65.2％)，經(jīng)典株陽性樣品233份(15.4%)；臨床健康豬中變異株陽性樣品53份(5.7%)，經(jīng)典株陽性樣品65份

4、(7．O%)。NSP2基因測(cè)序結(jié)果表明在中國部分地區(qū)存在2種不同NSP2基因型毒株（經(jīng)典株和變異株）的廣泛流行，但PRRSV變異株的氨基酸缺失位置和數(shù)目并不完全一致，氨基酸同源性為44.0%-100%。ORF5測(cè)序結(jié)果顯示在各個(gè)PRRSV分離株內(nèi)存在著大量氨基酸的點(diǎn)突變，氨基酸同源性為86.6%-100%。上述結(jié)果表明：我國豬群中PRRSV變異株和經(jīng)典株同時(shí)廣泛流行，但變異株占優(yōu)勢(shì)；臨床健康豬群中也存在較多的PRRSV隱性感染；ORF5

5、、NSP2基因變異現(xiàn)象普遍存在，不同地區(qū)PRRSV分離株的遺傳關(guān)系存在交叉現(xiàn)象，地域特征不明顯。
　　 2、 PRRSV變異株和經(jīng)典株感染仔豬的差異性分析
　　 將豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株(VS-PRRSV)和經(jīng)典株(CS-PRRSV)感染仔豬，對(duì)其致病性和血液學(xué)、免疫學(xué)的指標(biāo)進(jìn)行了比較。選擇15頭3周齡健康商品仔豬，隨機(jī)平均分為3組。每組豬分別于頸部肌肉接種VS-PRRSV、CS-PRRSV和生理鹽水，接種后隔離飼

6、養(yǎng)觀察7周。觀察臨床癥狀、病理組織學(xué)變化，檢測(cè)抗體水平及免疫相關(guān)的指標(biāo)．試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)VS-PRRSV感染組獵體溫急劇升高到41℃以上，臨床癥狀更加嚴(yán)重，發(fā)病率100%，死亡率80%；肺臟間質(zhì)性肺炎嚴(yán)重，肺泡膈增厚，巨噬細(xì)胞大量浸潤(rùn)；CD4和CD8 T淋巴細(xì)胞數(shù)下降更加迅速，恢復(fù)更為緩慢，CD4/CD8比值在10～21 dpi時(shí)顯著低于陰性對(duì)照組和CS-PRRSV感染組；VS-PRRSV感染組豬出現(xiàn)持續(xù)35天的病毒血癥，而CS-PRRSV

7、感染組只有28天；抗-PRRSVN蛋白抗體產(chǎn)生提前了3天，而中和抗體產(chǎn)生推遲了7天；Th1和Th2之間動(dòng)態(tài)平衡“漂移”次數(shù)增加1次；MHC-1、MHC-2及C3的mRNA水平在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)被抑制；而CS-PRRSV感染組豬僅出現(xiàn)輕微臨床癥狀和病理變化，免疫學(xué)指標(biāo)變化相對(duì)比較緩和。結(jié)果表明：接種VS-PRRSV后產(chǎn)生更加嚴(yán)重的致病性，細(xì)胞免疫及體液免疫均被進(jìn)一步抑制。
　　 3、華東豬群中PRRSV與TTSuVs混合感染的檢測(cè)<

8、br>　　 從江蘇、安徽、浙江、山東、上海、江西6省市2006-2010年間不同豬群中收集臨床有疑似PRRSV感染發(fā)病病死豬的組織樣品1457份，以及臨床健康豬的組織樣品927份。用PCR方法檢測(cè)各個(gè)樣品中PRRSV和TTSuV1、TTSuV2。結(jié)果表明：1457份臨床發(fā)病豬樣品中，三種病毒的檢出率分別為71.7%(PRRSV)、58.4%(TTSuV1)和48.0%(TTSuV2)，單重感染和陰性個(gè)體僅占23.5%和4.9%，且存在

9、非常嚴(yán)重的雙重感染(67.6%)和三重感染(11.4%)。927份臨床健康豬的組織樣品中，三種病毒的檢出率分別為7.7%(PRRSV)、49.4%(TTSuV1)和55.7%(TTSuV2)，單重感染和陰性個(gè)體為37.3%和10.8%，雙重感染和三重感染僅占7.1%和2.4%。PRRSV陽性樣品中TTSuV1(65.3%)和TSuV2(49.8%)的感染率均較高，TTSuVs總感染率高達(dá)94.3%; PRRSV陰性樣品中TTSuVl(4

10、7.2%)和ITSuV2(54.1%)的感染率也較高，TTSuVs總感染率仍高達(dá)86.4%。結(jié)果表明PRRSV、TTSuV1和TTSuV2在華東地區(qū)豬群中廣泛分布，臨床發(fā)病豬的PRRSV和TTSuVs的檢出率明顯高于臨床健康豬，TTSuV1和（或）TTSuV2極有可能對(duì)PRRSV等病毒感染有協(xié)同作用。
　　 4、 TTSuVI自然感染對(duì)PRRS活疫苗免疫效果的抑制作用
　　 為研究豬細(xì)環(huán)病毒1型( TTSuV1)自然感染

11、對(duì)藍(lán)耳病活疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的影響，本實(shí)驗(yàn)從中國江蘇兩家豬場(chǎng)選擇了4周齡的TTSuV1陽性豬15頭和陰性豬20頭。TTSuV1陽性豬平均分成三組，陰性豬平均分成四組。6周齡用藍(lán)耳病活疫苗進(jìn)行免疫，10周齡用強(qiáng)毒力PRRSV攻毒。同時(shí)設(shè)立TTSuV1陰性對(duì)照組和非免疫對(duì)照組。試驗(yàn)過程中，檢測(cè)了PRRS MLV免疫后仔豬的免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子變化和保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：疫苗免疫實(shí)驗(yàn)中，TTSuV1陽性免疫組（D組）的PRRS病毒抗體、IFN

12、-γ、IL-10水平和T淋巴細(xì)胞增殖能力全程低于TTSuV1陰性免疫組（B組），但僅在28dpi時(shí)D組抗體水平（S/P值：2.05）明顯低于B組(S/P值：2.21，P

13、的攻毒試驗(yàn)中，TTSuV1陽性免疫組（F組）出現(xiàn)比TTSuV1陰性免疫組（E組）更加嚴(yán)重的臨床癥狀，肺臟病變更加明顯(p<0.005），F(xiàn)組抗體水平在攻毒后7～14天顯著低于E組(P　　 5、TTSuV1自然感染

14、在PRRSV陽性豬體內(nèi)的病毒分布
　　 為深入研究探討豬自然感染豬細(xì)環(huán)病毒1型( Torque teno sus virus，TTSuV1)后病毒在豬繁殖與呼吸綜合征病毒( PRRSV)陽性豬體內(nèi)的分布情況，分析病毒對(duì)豬器官組織的嗜性，揭示豬細(xì)環(huán)病毒的致病機(jī)制。利用建立的TTSuV1 SYBR Green1實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，定量檢測(cè)自然感染豬和同時(shí)混合感染有豬繁殖與呼吸綜合征病毒的仔豬器官組織中TTSuV1 DNA的相對(duì)含

15、量，分析豬細(xì)環(huán)病毒的組織嗜性及其與豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染時(shí)的相互作用機(jī)制。結(jié)果在多種器官組織中均可檢測(cè)到TTSuV1，在感染仔豬的脾臟、肺臟、胰臟、氣管、腸系膜淋巴結(jié)(MLN)和腹股溝淋巴結(jié)( ILN)中TTSuV1 DNA含量較高，為3.5×107拷貝/g-2.3×los拷貝/g;肝臟、肛拭子和鼻拭子中含量較低，為1.9×107拷貝/g-2.7×107拷貝/g;心臟、脂肪和腸中沒有檢測(cè)到該病毒。TTSuV1和PRRSV混合感染