轉Bt基因水稻根際微生物的遺傳多樣性分析.pdf

1、土壤環(huán)境安全性是轉基因植物安全性評價中重要的內容,轉基因植物可通過不同途徑向土壤釋放外源基因及其表達產物,對土壤微生物產生選擇壓,進而可能對土壤微生物產生影響。本文在建立了兩種可用于土壤微生物遺傳多樣性分析新技術的基礎上,研究了2個轉Bt基因水稻對土壤微生物遺傳多樣性的影響。主要結果如下:
　　 1.通過對PCR反應成分的測試,建立了可用于植物根際土壤微生物SRAP的適宜反應體系,包含1×PCR緩沖液、2 mmol/L MgCl

2、2、0.2 mmol/L.dNTPs、0.4μmol/L引物,30 ng模板DNA和1 U Taq DNA聚合酶;在對退火溫度進行測試的基礎上,確定了擴增程序:94℃5 min;94℃45 s,35℃1 min,72℃1 min30 s,共5個循環(huán);94℃45 s,50℃1 min,72℃1 min30 s,共35個循環(huán);72℃延伸10min。進一步采用22對引物組合對20種植物根際土壤微生物進行了分析,共獲得237個擴增位點,其中多態(tài)

3、性位點221個,占93.2％。平均每對引物組合的多態(tài)性位點百分數(shù)(PPL)、多態(tài)性信息含量(PIC)、等位基因單體型(Ah)協(xié)和遺傳雜合度(He)分別為93.78、0.94、18.05和0.92,這些較高的參數(shù)一方面說明SRAP對根際土壤微生物的遺傳基礎具有較強的鑒別能力,另一方面反映了本研究中20種不同植物的根際土壤微生物具有豐富的遺傳多樣性。2個不同種植地和4個不同發(fā)育時期間的根際土壤微生物遺傳距離差異極顯著,但2個不同水稻品種間的

4、差異不顯著。Shannon多樣性指數(shù)揭示,水稻根際土壤微生物的遺傳多樣性最低,萵苣的最高。按照非加權類平均法(UPGMA)聚類,在遺傳距離0.454的水平上,可將20種植物根際土壤微生物分為三類:第一類是水稻根際土壤微生物,第二類是種植于大棚溫室的芹菜根際土壤微生物,第三類為其余18種旱作植物根際土壤微生物。結果證明SRAP是分析土壤微生物遺傳多樣性的有效手段。
　　 2.采用27對引物組合分別對轉歷基因水稻TT51、華池B6及

5、其對照明恢63和嘉早935的根際土壤微生物進行了SRAP分析。兩個轉基因水稻TT51與華池B6在同一種植點根際微生物遺傳距離無顯著差異,但在不同地點(華家池和建德)的遺傳距離差異極顯著,不同發(fā)育時期間的差異則隨地點不同而變化;轉基因水稻品種TT51和華池B6的根際土壤微生物在各自的4個生育期之間不存在明顯差異:兩對轉基因與各自對照間在不同時期、不同地點種植,根際微生物的遺傳多樣性均沒有差異,表明轉Bt基因水稻TT51和華池B6的種植未對

6、根際土壤微生物的遺傳多樣性產生影響。
　　 3.以含有單個錯配堿基的DNA異質雙鏈為底物鑒定了芹菜CELI粗提物的錯配切割酶學活性,并對影響其切割錯配的反應條件進行了優(yōu)化,建立了以自制CELI粗提物為基礎的點突變酶學檢測技術。自制的CELI粗提物能有效地識別和切割DNA異質雙鏈中堿基錯配。在當異質雙鏈DNA量恒定時,在一定的范圍內CEL,I粗提物用量的影響不明顯,由PCR產物形成的12μL異質雙鏈DNA可用蛋白質總量約900ng

7、的CEL I粗提物進行有效切割。常規(guī)PCR緩沖液與已報道的CELI緩沖液的效果基本相近,實際工作中可選用PCR緩沖液作CELI酶切反應液;緩沖液pH值對錯配切割效果具有明顯的影響,適宜的pH約近中性。Zn2+對錯配切割具有促進作用,但不是必需的,適宜的濃度為0.25mmol/L。CELI粗提物切割錯配的反應時間以42℃下酶切20min為宜。比較試驗結果表明,本研究建立技術的點突變檢測效果與Transgenomic公司試劑盒Surveyo

8、rTM基本相同。進一步將這種點突變檢測技術結合于Eco-TILLING,并對水稻根際微生物16S rDNA序列單核苷酸變異進行了分析,證明本研究建立的Eco-TILLING可有效地用于土壤微生物基因多樣性分析。
　　 4.分別未標記和熒光標記的Eco-TILLING技術分析了轉Bt基因水稻TT51與對照明恢63、轉基因水稻華池B6與對照嘉早935根際土壤微生物16S rDNA的差異。TT51根際土壤微生物形成的雜合DNA、TT5