轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際微生物的遺傳多樣性分析.pdf

1、土壤環(huán)境安全性是轉(zhuǎn)基因植物安全性評價(jià)中重要的內(nèi)容,轉(zhuǎn)基因植物可通過不同途徑向土壤釋放外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物,對土壤微生物產(chǎn)生選擇壓,進(jìn)而可能對土壤微生物產(chǎn)生影響。本文在建立了兩種可用于土壤微生物遺傳多樣性分析新技術(shù)的基礎(chǔ)上,研究了2個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因水稻對土壤微生物遺傳多樣性的影響。主要結(jié)果如下:
　　 1.通過對PCR反應(yīng)成分的測試,建立了可用于植物根際土壤微生物SRAP的適宜反應(yīng)體系,包含1×PCR緩沖液、2 mmol/L MgCl

2、2、0.2 mmol/L.dNTPs、0.4μmol/L引物,30 ng模板DNA和1 U Taq DNA聚合酶;在對退火溫度進(jìn)行測試的基礎(chǔ)上,確定了擴(kuò)增程序:94℃5 min;94℃45 s,35℃1 min,72℃1 min30 s,共5個(gè)循環(huán);94℃45 s,50℃1 min,72℃1 min30 s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。進(jìn)一步采用22對引物組合對20種植物根際土壤微生物進(jìn)行了分析,共獲得237個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn),其中多態(tài)

3、性位點(diǎn)221個(gè),占93.2％。平均每對引物組合的多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)(PPL)、多態(tài)性信息含量(PIC)、等位基因單體型(Ah)協(xié)和遺傳雜合度(He)分別為93.78、0.94、18.05和0.92,這些較高的參數(shù)一方面說明SRAP對根際土壤微生物的遺傳基礎(chǔ)具有較強(qiáng)的鑒別能力,另一方面反映了本研究中20種不同植物的根際土壤微生物具有豐富的遺傳多樣性。2個(gè)不同種植地和4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期間的根際土壤微生物遺傳距離差異極顯著,但2個(gè)不同水稻品種間的

4、差異不顯著。Shannon多樣性指數(shù)揭示,水稻根際土壤微生物的遺傳多樣性最低,萵苣的最高。按照非加權(quán)類平均法(UPGMA)聚類,在遺傳距離0.454的水平上,可將20種植物根際土壤微生物分為三類:第一類是水稻根際土壤微生物,第二類是種植于大棚溫室的芹菜根際土壤微生物,第三類為其余18種旱作植物根際土壤微生物。結(jié)果證明SRAP是分析土壤微生物遺傳多樣性的有效手段。
　　 2.采用27對引物組合分別對轉(zhuǎn)歷基因水稻TT51、華池B6及

5、其對照明恢63和嘉早935的根際土壤微生物進(jìn)行了SRAP分析。兩個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51與華池B6在同一種植點(diǎn)根際微生物遺傳距離無顯著差異,但在不同地點(diǎn)(華家池和建德)的遺傳距離差異極顯著,不同發(fā)育時(shí)期間的差異則隨地點(diǎn)不同而變化;轉(zhuǎn)基因水稻品種TT51和華池B6的根際土壤微生物在各自的4個(gè)生育期之間不存在明顯差異:兩對轉(zhuǎn)基因與各自對照間在不同時(shí)期、不同地點(diǎn)種植,根際微生物的遺傳多樣性均沒有差異,表明轉(zhuǎn)Bt基因水稻TT51和華池B6的種植未對

6、根際土壤微生物的遺傳多樣性產(chǎn)生影響。
　　 3.以含有單個(gè)錯(cuò)配堿基的DNA異質(zhì)雙鏈為底物鑒定了芹菜CELI粗提物的錯(cuò)配切割酶學(xué)活性,并對影響其切割錯(cuò)配的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,建立了以自制CELI粗提物為基礎(chǔ)的點(diǎn)突變酶學(xué)檢測技術(shù)。自制的CELI粗提物能有效地識別和切割DNA異質(zhì)雙鏈中堿基錯(cuò)配。在當(dāng)異質(zhì)雙鏈DNA量恒定時(shí),在一定的范圍內(nèi)CEL,I粗提物用量的影響不明顯,由PCR產(chǎn)物形成的12μL異質(zhì)雙鏈DNA可用蛋白質(zhì)總量約900ng

7、的CEL I粗提物進(jìn)行有效切割。常規(guī)PCR緩沖液與已報(bào)道的CELI緩沖液的效果基本相近,實(shí)際工作中可選用PCR緩沖液作CELI酶切反應(yīng)液;緩沖液pH值對錯(cuò)配切割效果具有明顯的影響,適宜的pH約近中性。Zn2+對錯(cuò)配切割具有促進(jìn)作用,但不是必需的,適宜的濃度為0.25mmol/L。CELI粗提物切割錯(cuò)配的反應(yīng)時(shí)間以42℃下酶切20min為宜。比較試驗(yàn)結(jié)果表明,本研究建立技術(shù)的點(diǎn)突變檢測效果與Transgenomic公司試劑盒Surveyo

8、rTM基本相同。進(jìn)一步將這種點(diǎn)突變檢測技術(shù)結(jié)合于Eco-TILLING,并對水稻根際微生物16S rDNA序列單核苷酸變異進(jìn)行了分析,證明本研究建立的Eco-TILLING可有效地用于土壤微生物基因多樣性分析。
　　 4.分別未標(biāo)記和熒光標(biāo)記的Eco-TILLING技術(shù)分析了轉(zhuǎn)Bt基因水稻TT51與對照明恢63、轉(zhuǎn)基因水稻華池B6與對照嘉早935根際土壤微生物16S rDNA的差異。TT51根際土壤微生物形成的雜合DNA、TT5