鋸緣青蟹呼腸孤病毒與雙順?lè)醋硬《緳z測(cè)方法及分子流行病學(xué)研究.pdf

1、鋸緣青蟹(Scylla serrata)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)蟹類，2005年從暴發(fā)“嗜睡癥”的蟹中分離出兩種大小不同的病毒，較大的病毒直徑為60-70nm，經(jīng)DNA酶及RNA酶消化后確定為雙鏈RNA病毒，基因組由12節(jié)段的雙鏈RNA組成，屬于呼腸孤病毒科，命名為鋸緣青蟹呼腸孤病毒(Mud Crab Reovirus，MCRV)；較小的病毒直徑為20-30nm，經(jīng)DNA酶及RNA酶消化后確定為單鏈RNA病毒，基因組由一條單鏈RNA組成，全基因

2、組測(cè)序完成后，經(jīng)過(guò)分析，具有雙順?lè)醋硬《究频奶卣?，命名為鋸緣青蟹雙順?lè)醋硬《?Mud Crab Dicistrovirus，MCDV)。這兩種病毒對(duì)鋸緣青蟹都有很強(qiáng)的致病性，本文對(duì)這兩種病毒的檢測(cè)方法、流行病學(xué)進(jìn)行了研究。
　　 本文建立了呼腸孤病毒和雙順?lè)醋硬《镜奶禺愋猿彩絇CR方法，檢測(cè)限可分別達(dá)到0.003pg和0.002pg，運(yùn)用該方法檢測(cè)不同感染時(shí)期不同組織中的呼腸孤病毒和雙順?lè)醋硬《?，在注射感染早期的樣品中，只用一?/p>

3、PCR可以在心、肝胰腺、腸、胃、食道、肌肉、胸神經(jīng)節(jié)、鰓、血中檢測(cè)到呼腸孤病毒；只用一步PCR可以在心、肝胰腺、腸、食道、肌肉、胸神經(jīng)節(jié)、鰓、血淋巴中檢測(cè)到雙順?lè)醋硬《?，用巢式PCR可以在胃中檢測(cè)到雙順?lè)醋硬《荆辉跒l死的樣品中，只用一步PCR就可以在上述共九種組織中檢測(cè)到這兩種病毒。運(yùn)用巢式PCR于2009年8月到2010年2月對(duì)粵中海區(qū)共21種野生蟹類進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，均未檢測(cè)出兩種病毒，但是，于2008年至2010年對(duì)廣州南沙及珠海

4、養(yǎng)殖場(chǎng)的鋸緣青蟹檢測(cè)結(jié)果表明，呼腸孤病毒感染率較高，在43％以上，雙順?lè)醋硬《镜母腥韭试?％以上。
　　 建立了針對(duì)這兩種病毒的特異性熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法(Taqman探針?lè)?，運(yùn)用該方法檢測(cè)不同感染時(shí)期不同組織中呼腸孤病毒和雙順?lè)醋硬《镜牧?，結(jié)果顯示，這兩種病毒在鋸緣青蟹心臟、鰓、肌肉、肝胰腺、血淋巴中均有分布，呼腸孤病毒量組織從多到少依次為：鰓、心臟、肝胰腺、肌肉、血淋巴；組織雙順?lè)醋硬《痉植剂繌亩嗟缴俜謩e是鰓、肝胰腺、心

5、臟、血淋巴、肌肉。把檢測(cè)結(jié)果與蟹的死亡率聯(lián)系起來(lái)，推測(cè)雙順?lè)醋硬《九c呼腸孤病毒共同作用引起鋸緣青蟹死亡。
　　 本文進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)，分別用注射、投喂、浸泡、禁食浸泡、共居的方式研究這兩種病毒的感染途徑，用巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，呼腸孤病毒及雙順?lè)醋硬《灸芡ㄟ^(guò)人工注射、浸泡、禁食浸泡、投喂、共居的方式感染鋸緣青蟹。人工注射感染方式感染率最高，而且死亡出現(xiàn)的時(shí)間最早，投喂感染方式較浸泡、共居方式MC