豬戊型肝炎病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查及ORF2區(qū)的克隆和表達(dá).pdf

1、戊型肝炎是一種由戊型肝炎病毒引起的，經(jīng)過糞-口途徑傳播的新發(fā)傳染病和人畜共患病。人與豬易感，其中豬是重要的儲(chǔ)存宿主和傳染源。
　　 本研究首先應(yīng)用HEVELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)湖北地區(qū)4個(gè)豬場(chǎng)80份血清進(jìn)行HEV抗體IgG檢測(cè)，結(jié)果顯示檢測(cè)的80份血清中陽(yáng)性血清56份，抗-HEV抗體陽(yáng)性率高達(dá)70.0％。
　　 在此基礎(chǔ)上，從2007到2009年，我們從湖北、河南、安徽及湖南四省采集豬臨床肝臟樣品及肛拭子樣品共計(jì)583

2、份，根據(jù)GenBank中的序列（登錄號(hào)DQ279091）設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，應(yīng)用套式RT-PCR方法檢測(cè)HEVRNA。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒并測(cè)序，利用生物學(xué)軟件對(duì)其遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析。結(jié)果表明：從樣品分析，HEV總陽(yáng)率為9.6％(56/583)，肝臟樣品陽(yáng)性率為15.55％(21/135)，肛拭子樣品陽(yáng)性率為7.81％(35/448)；從豬場(chǎng)分析，9個(gè)豬場(chǎng)中有5個(gè)豬場(chǎng)存在HEV，豬場(chǎng)陽(yáng)性率平均為55.56％(

3、5/9)。將其中具有代表性的兩株病毒的PCR產(chǎn)物克隆并提交NCBI，獲得了GenBank登錄號(hào)，其中肝臟樣品登錄號(hào)為：GQ202266，肛拭子樣品登錄號(hào)為：FJ445406。序列分析表明：38株陽(yáng)性樣品之間同源性為92-100％，與戊型肝炎病毒基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型同源性分別為77％、77％、87％、96％。遺傳進(jìn)化分析顯示，從肛拭子中分離的毒株(FJ445406)與豬源毒株DQ279091處在同一分支上，屬于基因4型；肝臟中分離的毒株(

4、GQ202266.1)雖然處在4型分支上，但和4型人源毒株處在一個(gè)亞支，屬于4型中另一亞型，提示該毒株可能是與人源毒株親緣關(guān)系較近?？傮w來(lái)講，華中地區(qū)豬群中存在HEV，其基因型相對(duì)穩(wěn)定，屬同一基因型（4型）。
　　 由于戊型肝炎病毒缺乏有效的細(xì)胞模型，研究進(jìn)展相當(dāng)緩慢。我們?cè)谇叭搜芯康幕A(chǔ)上，利用A549和IBRS-2、HepG2三種細(xì)胞系分別接種HEV的肝臟樣品和肛拭子樣品，并作3次重復(fù)。結(jié)果表明：A549和IBRS-2兩種細(xì)

5、胞系均能增殖HEV病毒，并能穩(wěn)定傳代。其中在A549細(xì)胞系中病毒能連續(xù)傳代21代；IBRS-2細(xì)胞系中病毒能連續(xù)傳代12代以上。用RT-nPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)核酸發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞中第一代（前4天）檢測(cè)不出HEVRNA，但在IBRS-2中卻能檢測(cè)到。以上研究進(jìn)一步豐富了HEV細(xì)胞模型。
　　 此外，本研究參照GenBank上登錄的人源AJ272108的cDNA序列設(shè)計(jì)了5對(duì)套式RT-PCR引物，分別擴(kuò)增ORF2、VLP1、VLP2、

6、NE基因。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體并測(cè)序，然后亞克隆至原核表達(dá)載體pET-28a，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-ORF2(1aa-674aa)、pET-VLP1(134aa-625aa)、pET-VLP2(147aa-540aa)、pET-NE(407aa-620aa)。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和Westernblot蛋白印跡分析。結(jié)果表明：構(gòu)建的4個(gè)重組質(zhì)粒中pET-OR