二倍體D組棉種染色體特異BAC克隆的篩選及其應(yīng)用.pdf

1、棉花是世界上最重要的纖維經(jīng)濟(jì)作物。目前，棉花的全基因組測序工作已進(jìn)入日程，而棉花高分辨率細(xì)胞遺傳學(xué)圖的構(gòu)建是基因組研究中重要而基礎(chǔ)的工作。以遺傳圖譜不同染色體上的分子標(biāo)記為媒介，在BAC文庫中篩選并獲得染色體特異的BAC克隆，以它們?yōu)樘结樳M(jìn)行熒光原位雜交完全識(shí)別染色體進(jìn)而對(duì)遺傳圖與細(xì)胞學(xué)圖進(jìn)行整合的策略在其它作物中得到了廣泛應(yīng)用。
　　 為加快棉花高分辨率的細(xì)胞遺傳學(xué)圖的成功構(gòu)建，本研究對(duì)染色體特異BAC克隆的篩選、鑒定等工作進(jìn)

2、行了一定的嘗試，并且經(jīng)過實(shí)驗(yàn)論證得到了一套可以識(shí)別二倍體D組染色體的特異BAC探針。在獲得兩種rDNA BAC克隆的基礎(chǔ)上，對(duì)7個(gè)二倍體組棉種的rDNA位點(diǎn)分布進(jìn)行了探討。應(yīng)用45S rDNA、5S rDNA及D組著絲粒區(qū)域BAC探針，在瑟伯氏棉粗線期染色體上構(gòu)建了高分辨的棉花細(xì)胞學(xué)圖，這為D組染色體的特異BAC探針在粗線期上的最終應(yīng)用及構(gòu)建D組棉花高分辨率的細(xì)胞遺傳學(xué)圖，奠定了工作基礎(chǔ)。
　　 研究結(jié)果如下：
　　 ●

3、利用來自于遺傳連鎖圖譜（Han et al.2006）上的染色體特異SSR.標(biāo)記NAU2440（Chr.3）、NAU2353（Chr.10）、BNL3103（Chr.25）從Pima90 BAC文庫中分別篩選到的425-D-2、429-J-7、189-I-4 BAC克隆，經(jīng)FISH鑒定上述BAC克隆可以產(chǎn)生染色體特異的雜交信號(hào)。因此，BAC克隆425-D-2、429-J-7、189-I-4可以做為識(shí)別棉花Chr.3、Chr.10、Chr

4、.25的染色體特異BAC探針。
　　 ●在得到一套棉花染色體特異BAC克隆的基礎(chǔ)上，利用雙色FISH技術(shù)，以本實(shí)驗(yàn)室篩到的D組著絲粒區(qū)域探針（BAC150D24）區(qū)分染色體長短臂，成功地將13個(gè)Dt組染色體特異BAC克隆分別定位在二倍體D組瑟伯氏棉中期染色體臂上，F(xiàn)ISH雜交結(jié)果顯示：Dt組的13個(gè)BAC探針在對(duì)應(yīng)的D組染色體上都能產(chǎn)生染色體特異的熒光信號(hào)。并通過Dt組與D組染色體的同源轉(zhuǎn)化關(guān)系確定了D組染色體的命名。
　

5、　 ●物理圖譜與遺傳圖譜的比較作圖分析13個(gè)Dt組染色體特異克隆中，盡管部分標(biāo)記位于連鎖群的中部，但相應(yīng)克隆的原位雜交定位顯示，其位于染色體的末端或近末端處，這暗示了棉花基因組中染色體的遠(yuǎn)端往往是重組活躍區(qū)段；也有位于遺傳連鎖圖末端或近末端處的分子標(biāo)記被定位在染色體中部的情況，這可能是連鎖群的覆蓋度較低造成的。13個(gè)探針在Dt與D組染色體上物理分布有較好的一致性，證明了Dt與D組染色體間確實(shí)存在大片段的染色體同源區(qū)段。
　　

6、●鑒于rDNA自身為高度重復(fù)序列，可做為識(shí)別染色體的FISH標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)利用45S和5S rDNA引物，從Pima90 BAC庫中篩選得到4個(gè)45S rDNA BAC克?。?81－C－3、181－J－11、183－C－22、183－G－12；2個(gè)5S rDNA BAC克隆：182-F-9、188－H－17，并通過FISH對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)得到的45S rDNA BAC克隆進(jìn)行BAC末端測序，從中得到了一段533bp的DNA片段，在NCB

7、I數(shù)據(jù)庫中與已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果與茶樹、木棉樹、玉蘭、蓮屬以及一些動(dòng)物的28S序列同源達(dá)到98％。
　　 ●在獲得棉花rDNA BAC克隆的基礎(chǔ)上，選取了A、B、C、D、E、F、G，7個(gè)組二倍體棉種的各自代表種為研究對(duì)象，探討其rDNA位點(diǎn)及7個(gè)組的45S與5S線性關(guān)系情況。發(fā)現(xiàn)所用7個(gè)組的二倍體棉種45S信號(hào)多為3－4對(duì)，但信號(hào)強(qiáng)度大小不盡相同；5S信號(hào)除E組的灰白棉為2對(duì)外其它均為1對(duì)。45S與5S線性關(guān)系：A、

8、C、D、F、G組的45S與5S均為共線性形式存在，而B組的兩個(gè)棉種及E組的索馬里棉、亞雷西棉，其45S與5S是非共線性的；E組的灰白棉5S位點(diǎn)為2對(duì)，其中一對(duì)單獨(dú)存在，而另一對(duì)與45S位點(diǎn)共線性。發(fā)現(xiàn)的特殊rDNA位點(diǎn)染色體組-B、E、F組，在棉屬分類工作中可以起到重要的作用?？偨Y(jié)四種rDNA位點(diǎn)分布模式，就rDNA的演化過程推測：二倍體棉種中，非共線分布--B組棉種及與其相近的E組棉索馬里棉、亞雷西棉為最接近棉屬祖先的原始種群，它朝著