花生抗青枯病的分子生物學基礎(chǔ)研究.pdf

1、花生(Arachis hypogaeaL.)是世界上重要的經(jīng)濟作物和油料作物。由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染花生引起的青枯病(Bacterial Wilt)是影響熱帶、亞熱帶以及部分溫帶地區(qū)花生生長的重要細菌性病害；在我國尤以長江流域以及南方地區(qū)較為嚴重。作為一種土傳性病害，花生青枯病目前尚沒有有效的化學防治手段，與其他作物輪作、間套作及利用生物防治等防治效果也非常有限，因此防治花生青枯病的根本手段還

2、是培育抗病品種。但是由于缺少優(yōu)良的抗病基因源、抗性表現(xiàn)受環(huán)境影響較大以及青枯菌菌系分化的復雜性等，都嚴重影響了花生抗病育種進程。由于青枯雷爾氏菌復雜的多態(tài)性、田間鑒定結(jié)果的不穩(wěn)定性，岡此尋求快速、簡便、準確而不受時間限制的室內(nèi)接種鑒定方法則顯得非常重要。目前國內(nèi)外對花生青枯病的研究不多，控制花生對青枯病抗性的基因種類和數(shù)量以及它們的表達調(diào)控機制還不清楚，花生抗青枯病的分子生物學研究基礎(chǔ)還比較薄弱。本研究建立了簡便快速的花生青枯病的抗性鑒

3、定方法，構(gòu)建了受青枯菌誘導的花生根全長cDNA文庫，也構(gòu)建了攜帶擬南芥抗青枯病基因RRS1的表達載體，為了解花生青枯菌的侵染和花生抗青枯病機理，奠定前期工作基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：
　　 1．選取不同的花生青枯菌菌株，采用傷根灌菌液法接種中感品種閩花6號，測定菌株的致病力差異，菌株431致病力較強，是理想的接種菌株。通過比較幾種不同的侵染方法接種花生，觀察了抗感品種的發(fā)病情況，確定了較為理想的抗性鑒定方法。傷根灌菌液法雖然能夠反映品

4、種的抗性，但是由于菌液接種量大、發(fā)病周期較長給實驗帶來了許多不便；葉腋注射法不能反映品種的抗感性，而且操作繁瑣，我們不予采納：剪葉法接種后25d就能反映出品種的抗性，發(fā)病周期短，而且操作性強以及接種量小，是理想方便的接種方法。總之，傷根灌菌液法和剪葉法都能說明品種的抗性，剪葉法優(yōu)于傷根灌菌液法。
　　 2．通過傷根灌菌液法接種抗青枯病品種閩花8號，利用SMART技術(shù)構(gòu)建了受青枯菌誘導的花生根處理和對照全長cDNA混合文庫。初級文

5、庫滴度為1.902×106cfu/m1，插入率99％，插入片段大小在500～2500bp之間，平均為1200bp;擴增文庫滴度為9.68×1011cfu/ml。從文庫中隨機挑取24個克隆進行兩端測序，經(jīng)過生物信息學分析45％的序列為預測蛋白，功能未知，這說明花生基因組學研究相對薄弱。隨機挑取74個克隆進行兩端測序，利用BLAST2GO軟件進行注釋和功能分析。序列經(jīng)注釋后功能分析將已知功能的EST按照細胞組分、分子功能和參與生物過程分為三

6、大類，在細胞組分一類中，大多數(shù)被歸類為線粒體(mitochondrion)和細胞質(zhì)膜(plasma membrane)兩類；在分子功能的分類中，結(jié)合(binding)和催化活性(catalytic activity)居多；在生物過程的分類中，分為代謝過程(metabolic process)和細胞過程(cellular process)的比較多。物種相似性分布分析與水稻、葡萄、擬南芥較為相似，說明花生上仍有大量的待發(fā)掘功能基因。

7、　　 3．根據(jù)已經(jīng)登錄的RRS1-R基因序列設(shè)計引物，通過RT-PCR從擬南芥Nd-1中克隆得到4137bp的抗青枯病基因RRS1-R，與GenBank上登錄的原序列同源性達99％，將該基因片斷連入植物表達載體pSC1301，構(gòu)建帶抗青枯病基因的植物表達載體pSC1301-RRS1，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。然后準備對煙草進行了遺傳轉(zhuǎn)化進而進行功能驗證，后續(xù)工作正在進行中。
　　 本項目還同時開展了花生對青枯病的抗性遺傳和抗性基