胃蛋白酶提取烏賊皮中膠原蛋白的工藝研究【開題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報(bào)告</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　胃蛋白酶法提取烏賊皮中膠原蛋白的工藝研究</p><p>　　一、選題的背景與意義</p>

2、<p>　　膠原蛋白是構(gòu)成生物體最重要的結(jié)構(gòu)蛋白,在人體中是皮膚、血管、骨骼、軟骨及結(jié)締組織最主要的蛋白質(zhì)。膠原蛋白占哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白總量的25% -30% ,體重的6%。膠原蛋白用途廣泛,其制品已應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品、化妝品等眾多領(lǐng)域。如膠原護(hù)膚霜、膠原面膜、膠原美容口服片等系列產(chǎn)品,其內(nèi)服外用效果良好,滿足了當(dāng)前消費(fèi)者對功能性產(chǎn)品的強(qiáng)烈需求;目前在歐美國家,服用膠原產(chǎn)品進(jìn)行皮膚深層養(yǎng)護(hù)已成時(shí)尚[11]。據(jù)專家預(yù)測,我

3、國的膠原熱潮也即將到來。膠原也是人類皮膚的主要組成成分。</p><p>　　牛和豬的皮、骨頭通常是膠原蛋白的主要來源，然而，牛海綿狀腦?。˙SE）、傳染性海綿狀腦?。═SE） 和口蹄疫（FMD）的爆發(fā)使得人們對陸生動(dòng)物來源的膠原蛋白及其衍生產(chǎn)品的安全性產(chǎn)生恐慌[3]。另外，由于宗教因素，如猶太教和伊斯蘭教，從豬來源提取的膠原蛋白作為食物的組分，其應(yīng)用受到限制[2]。因此尋找可替代的新來源的膠原蛋白就顯得非常迫切

4、[4]。</p><p>　　烏賊加工會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料,如烏賊皮、側(cè)鰭、內(nèi)臟、內(nèi)骨骼等,如果不進(jìn)行有效處理,不僅會(huì)造成環(huán)境的污染,而且會(huì)浪費(fèi)大量的寶貴資源。如能充分利用這些成分,不僅可提高烏賊加工的附加值,同時(shí)可減少環(huán)境污染,獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益[1]。而烏賊皮中膠原蛋白的含量很高，因此成為了可以代替豬、牛等陸生動(dòng)物的膠原潛在來源。</p><p>　　膠原蛋白的提取方法主要包括

5、酶提法和酸提法，而酶提法的膠原蛋白得率比酸提法要大得多[5]。酸溶脹的魚皮膠原具有更加松散的結(jié)構(gòu)，從而更易被蛋白酶作用[6]。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p>　　基本內(nèi)容：使用胃蛋白酶法提取烏賊皮中的膠原蛋白，并確定其最優(yōu)工藝</p><p><b>　　擬解決主要問題：</b></p>

6、<p><b>　　確定最佳醋酸濃度</b></p><p><b>　　確定最佳料液比</b></p><p><b>　　確定最佳加酶量</b></p><p><b>　　確定最佳提取時(shí)間 </b></p><p>　　三、研究的方法與

7、技術(shù)路線：</p><p>　　3.1 烏賊皮前處理</p><p>　　剖開魚體腹部，剝下烏賊皮-剪碎-脫脂-去雜蛋白-離心，去除上清液，制備勻漿液。</p><p><b>　　3.2 單因素試驗(yàn)</b></p><p>　　3.2.1酸濃度的選擇</p><p>　　0.1mol/L、0.5

8、mol/L、1.0mol/L、2.0mol/L</p><p>　　3.2.2 料液比的選擇</p><p>　　1：5、1：10、1：15、1：20</p><p>　　3.2.3提取時(shí)間的選擇</p><p>　　6h、12 h、24h 、36 h、48 h、</p><p><b>　　3.3 正交試驗(yàn)

9、</b></p><p>　　選取酸濃度（A）、料液比(B)、加酶量（C）提取時(shí)間(D)為試驗(yàn)因子，以膠原蛋白的提取率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行酶法提取工藝研究，對酶法提取烏賊皮中膠原蛋白的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到酶法提取的最佳工藝條件。</p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010.10.8-2010.12

10、.10 查閱資料，外文翻譯2篇，完成開題報(bào)告、文獻(xiàn)綜述、開題論證</p><p>　　2010.12.10-2011.4.10 做酸法提取烏賊皮中膠原蛋白的條件優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)，分別對酸濃度、料液比、提取時(shí)間、加酶量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定單因素實(shí)驗(yàn)各個(gè)因素的最佳條件</p><p>　　2011.4.10-2011.4.20 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對酸濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行正交試

11、驗(yàn)</p><p>　　2011.4.21-2011.4.30 整理數(shù)據(jù)，完成論文，畢業(yè)論文答辯</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 張虹,卓素珍,戴志遠(yuǎn).鮟鱇魚皮中膠原蛋白的提取及性質(zhì)研究[J].中國食品學(xué)報(bào).2009.12(6):34-40</p><p>　　[2]

12、張俊杰, 段蕊，許曉靜等.魷魚魚皮酶溶性膠原蛋白部分生化性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè).2009.35（12）:57-60</p><p>　　[3] 楊曉燕，賈福星.烏賊的綜合藥用[J].中國海洋藥物.1999（2）：46-47</p><p>　　[4] 黃煥， 王欣， 劉寶林.魚鱗膠原蛋白提取技術(shù)及其應(yīng)用[J].食品科技.2009.34（1）：208-211</p>&

13、lt;p>　　[5] 戶業(yè)麗, 吳潔, 張瑞等.酸法提取人工養(yǎng)殖鱘魚皮中膠原蛋白工藝的研究[J].食品科技；2008,2:209-212</p><p>　　[6] 王秋卓.膠原蛋白的開發(fā)利用與展望[J].河套大學(xué)學(xué)報(bào).2010,7（2）：28-33</p><p>　　[7] 郭玉華, 劉揚(yáng)瑞, 李鈺金.魚類膠原蛋白及膠原活性多肽的研究進(jìn)展[J].中國食品添加</p>

14、<p><b>　　劑</b></p><p>　　[8] 劉克海, 秦玉青, 徐海波. 魷魚皮膠原蛋白的提取及在化妝品中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)科</p><p>　　學(xué).2008,27（8）：411-413</p><p>　　[9] 陳冬英. 膠原蛋白在化妝品中的應(yīng)用[ J ]. 化工文摘,2002 (6) : 46</p&g

15、t;<p>　　[10]傅燕鳳, 沈月新, 楊承等. 淡水魚魚皮膠原蛋白的提取[ J ]. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào).2004(6):146-150</p><p>　　[11]閆鳴艷.狹鱈魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)和物理特性的研究[D]</p><p>　　[12]戶業(yè)麗，吳潔，張瑞等. 酸法提取人工養(yǎng)殖鱘魚皮中膠原蛋白工藝的研究[ J ].食品科技.2008:209-212</p&g

16、t;<p>　　[13] 胡二坤,郭興鳳,譚鳳. 豬皮中膠原蛋白的提取[ J ]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).2006:50-53</p><p>　　[14] 羅發(fā)興, 薛新順, 羅志剛. 酸溶液對豬皮中膠原蛋白溶出率的影響[ J ]. 中國釀造.2006:9-11</p><p>　　[15] Takeshi Nagaia, Yoko Araki, Nobutak

17、Suzukia. Collagen of the skin of ocellate puffer fish (Takifugu rubripes)[J] Food Chemistry 78 (2002) :173–177. </p><p>　　[16] Sitthipong Nalinanon, Soottawat Benjakul, Wonnop Visessanguan, Hideki Kishimura.

18、 Use of pepsin for collagen extraction from the skin of bigeye snapper (Priacanthus tayenus)[J] Food Chemistry 104 (2007) 593–601.</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程

19、</b></p><p>　　膠原蛋白的研究現(xiàn)狀綜述</p><p>　　摘要 本文綜述了膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能特性以及水解膠原蛋白的方法，主要包括及其在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用，并對其發(fā)展前景做了展望。</p><p>　　關(guān)鍵詞 膠原蛋白；水解；結(jié)構(gòu)；特性；應(yīng)用</p><p><b>　　1 前言</b&

20、gt;</p><p>　　膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質(zhì)， 占人體內(nèi)蛋白質(zhì)總25％ ，相當(dāng)于體重的6％, 為重要的功能性蛋白質(zhì),主要存在于動(dòng)物的皮、骨、軟骨、牙齒、肌腱、韌帶和血管中,是結(jié)締組織極重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的功能[1] 。</p><p>　　膠原蛋白的營養(yǎng)十分豐富。膠原蛋白富含除色氨酸和半胱氨酸外的18種氨基酸，其中維持人體生長所必需

21、的氨基酸有7種，膠原蛋白中的甘氨酸占30％ ，脯氨酸和羥脯氨酸共占25％ ，是各種蛋白質(zhì)中含量最高的，丙氨酸、谷氨酸的含量也比較高，同時(shí)還含有在一般蛋白中少見的羥脯氨酸和焦谷氨酸[2]。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，分子量為300kD，其分子在細(xì)胞外基質(zhì)中聚集為超分子結(jié)構(gòu)。膠原蛋白最普遍的結(jié)構(gòu)特征是三螺旋結(jié)構(gòu)，由3條a鏈多肽組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構(gòu)型，它們交叉相互纏繞成右手螺旋結(jié)構(gòu)，即超螺旋結(jié)構(gòu)，膠原蛋白獨(dú)特的三重螺旋結(jié)構(gòu)，

22、使其分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性等[3]。結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，性質(zhì)決定用途，膠原蛋白的結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性決定其在許多領(lǐng)域的重要地位。膠原蛋白產(chǎn)品具有良好的應(yīng)用前景[2]。</p><p>　　2 膠原蛋白的功能特性</p><p>　　膠原是人類皮膚的主要組成成分。人處于幼年時(shí),皮膚中膠原的含量高,隨著年齡的增長,其含量開始逐漸下降,導(dǎo)致皮膚漸漸喪失保濕功能,人體只有

23、不斷合成新膠原才能保持皮膚健康且具有彈性[7]。膠原蛋白的陰離子側(cè)鏈豐富,能吸附大量水分,維持皮膚的濕潤、彈性。膠原蛋白含有一種獨(dú)特的氨基酸———羥脯氨酸(Hyp)[9] ,合成新膠原蛋白時(shí)需要大量的羥脯氨酸。</p><p>　　在醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域里,因膠原蛋白具有良好的生物學(xué)特性和低免疫原性,它可作為組織的支持物,對細(xì)胞、組織乃至器官行使正常功能并對外傷修復(fù)具有重要作用[7]。</p><p&

24、gt;<b>　　2.1 低免疫原性</b></p><p>　　一般認(rèn)為膠原具有三種類型的抗原因子：第一類是由膠原肽鏈非螺旋的端肽引起的[25]；第二類是由膠原三螺旋的構(gòu)象引起的；第三類是由僅鏈螺旋區(qū)的氨基酸順序引起的。第二類抗原因子僅存在于天然膠原分子中，第三類只出現(xiàn)在變性膠原中，而第一類抗原因子在天然和變性膠原中均存在[6]。</p><p><b>

25、　　2.2 生物相容性</b></p><p>　　膠原蛋白的生物相容性是指膠原蛋白與宿主細(xì)胞及組織之間良好的相互作用。膠原本身是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的骨架，其三股螺旋結(jié)構(gòu)及交聯(lián)所形成的纖維或網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成了細(xì)胞重要組成成分，對細(xì)胞起到錨定和支持作用，并為細(xì)胞的增值生長提供適當(dāng)?shù)奈h(huán)境[6]。因此，膠原無論是在被吸收前作為新組織的骨架還是被吸收同化進(jìn)入宿主，成為宿主組織的一部分，都與細(xì)胞周圍的基質(zhì)有著良好的相互作

26、用，表現(xiàn)出相互影響的協(xié)調(diào)性，并成為細(xì)胞與組織正常生理功能整體的一部分[11] 。</p><p>　　2.3 可生物降解性[24]</p><p>　　膠原具有緊密牢固的螺旋結(jié)構(gòu)，絕大多數(shù)蛋白酶只能切斷膠原側(cè)鏈，只有膠原酶、彈性蛋白酶等中性蛋白酶可以降解膠原蛋白，斷裂膠原肽鍵，致使其螺旋結(jié)構(gòu)破壞，而徹底水解小分子多肽或氨基酸，小分子物質(zhì)可以進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，被機(jī)體重新利用或代謝排出[12]

27、。結(jié)締組織細(xì)胞或炎癥細(xì)胞能吞噬被膠原酶作用所得的大的片段，然后由溶酶體進(jìn)一步降解為小分子多膚或氨基酸 。膠原的可降解性是其作為器官移植材料的基礎(chǔ)[16]。</p><p>　　2.4 止血和修復(fù)功能[23]</p><p>　　膠原具有止血性能，該性能的發(fā)揮通過兩方面實(shí)現(xiàn)，即促進(jìn)血小板凝聚和血漿結(jié)塊 。膠原可以與血小板通過粘合、聚集形成血栓起到止血作用。當(dāng)血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞被剝離時(shí)，血管中的

28、膠原纖維暴露于血液中，血液中的血小板立刻與膠原纖維吸附在一起，發(fā)生凝聚反應(yīng)，生成纖維蛋白并形成血栓，進(jìn)而血漿結(jié)塊阻止血流。膠原的天然結(jié)構(gòu)特別是其足夠發(fā)達(dá)的四級結(jié)構(gòu)，是膠原具有凝聚能力的基礎(chǔ)。膠原是參與創(chuàng)傷愈合的主要結(jié)構(gòu)蛋白 。膠原蛋白還可促進(jìn)肉芽組織生成，加速創(chuàng)面的愈合。膠原分子對成纖維細(xì)胞的趨化反應(yīng)，使膠原在傷IZl愈合過程中起重要作用[23]。</p><p>　　3 膠原蛋白的提取方法[3,5,9,10,1

29、2,13]</p><p>　　水產(chǎn)品膠原蛋白的傳統(tǒng)提取方法大致可以分熱水提取法、酸處理法和酶處理法。</p><p>　　3.1 酸提取法[13]</p><p>　　酸提取法常用的酸有： 甲酸、乙酸、鹽酸、草酸、檸檬酸、乳酸等。低離子濃度酸可以破壞分子間鹽鍵和希夫氏堿，引起膠原纖維膨脹、溶解。林煒等使皮革固體廢棄物在pH值為2—3、溫度105℃、6moL／LHC

30、I條件下徹底水解8h來提取膠原，得到完全游離的氦基酸。戶業(yè)麗,吳潔,張瑞[12]等人對人工養(yǎng)殖的鱘魚皮膠原蛋白的提取工藝進(jìn)行詳細(xì)的探討如下: 采用酸法提取膠原蛋白, 對提取膠原蛋白過程中酸的種類、酸的濃度、用量、提取時(shí)間和提取溫度對膠原蛋白提取率的影響進(jìn)行詳細(xì)的研究。正交實(shí)驗(yàn)表明, 酸法提取人工養(yǎng)殖鱘魚皮中膠原蛋白的最佳工藝為以1.0 mol/L 的乳酸作為提取劑, 采用1∶5 的固液比,在20 ℃下提取72 h, 其提取率最高為86.

31、18%。</p><p>　　3.2 酶提取法[9,10,11]</p><p>　　用蛋白酶處理豬皮，不僅可以水解掉膠原纖維蛋白的末端肽，提高膠原蛋白的產(chǎn)率；而且還不會(huì)破壞膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，保持其優(yōu)良的物理和生化特性。通常使用的蛋白酶主要有中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等。影響酶提取的因素有很多，如酶濃度、酶與底物的比例、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值以及料液

32、比等。在實(shí)際操作中，大多數(shù)采用酶復(fù)合法提取膠原蛋白。Lafargue提及從魚皮、豬皮或牛皮中，采用蛋白酶酶解法提取制備膠原質(zhì)，其中蛋白酶可選用木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶等，經(jīng)脫脂脫磷、酸處理后可得到生物相容性好的魚皮膠原蛋白。</p><p>　　陳小娥, 方旭波, 鐘秋琴[3]在以安康魚皮為原料, 采用酶法提取膠原蛋白, 用正交實(shí)驗(yàn)對安康魚皮膠原蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化, 并測定了安康魚皮的基本組成成分和魚皮膠原蛋白的

33、氨基酸組成。結(jié)果表明, 胃蛋白酶添加量為1%, 料液比為1∶10, 酶解時(shí)間6h, 酶解溫度為5℃時(shí)魚皮膠原蛋白提取率最高, 提取率為11.01%[3]。</p><p><b>　　3.3 熱水提取法</b></p><p>　　熱水提取法是將原料經(jīng)過除雜蛋白等前處理之后，直接在熱水中提取已經(jīng)變性了的膠原蛋白或膠原蛋白水解物的方法，使用的溫度有100℃沸水浴、6O一

34、70℃ 、40-42℃ 、45 。錢曼等以草魚魚鱗為原料， 在料液比1：20(w／v)，121℃條件下提取5min，最后膠原蛋白的提取率為45．57％[16]。</p><p>　　目前生產(chǎn)膠原蛋白制品的主要原料是豬、牛等陸生哺乳動(dòng)物的皮、骨和肌腱,因近年來全球生態(tài)環(huán)境惡化導(dǎo)致瘋牛病、口蹄疫等流行病多次發(fā)生,使得從陸生動(dòng)物皮、骨中提取膠原蛋白的危險(xiǎn)性增大。歐美、日本等國家相繼出臺(tái)了不少法規(guī),限制將牛等哺乳動(dòng)物皮骨

35、中的提取物用于食品、醫(yī)藥等對人體有直接影響的產(chǎn)品中[7] 。為此,人們便開始尋求從水產(chǎn)動(dòng)物中提取膠原蛋白,從魚體廢棄物中提取安全、衛(wèi)生、無害的膠原蛋白已成為當(dāng)前國內(nèi)外業(yè)內(nèi)人士研發(fā)的一個(gè)熱門課題[24]</p><p>　　另外，魚品在加工的過程中,會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料,如果不進(jìn)行有效處理,不僅會(huì)造成環(huán)境的污染,而且會(huì)浪費(fèi)大量的寶貴資源。如能充分利用這些成分,不僅可提高魚類加工的附加值,同時(shí)可減少環(huán)境污染,獲得良好的

36、經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。膠原蛋白含量占魚體總蛋白的25 %～30 % ,主要分布于魚鱗和魚皮中,因此,充分、合理地利用廢棄物魚鱗、魚皮提取膠原蛋白不僅可推動(dòng)水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展,而且能變廢為寶,減少環(huán)境污染。本文以烏賊皮為例，對其中的膠原蛋白進(jìn)行了酸和酶同時(shí)提取的工藝研究。</p><p>　　4 膠原蛋白發(fā)展前景</p><p>　　膠原蛋白是一種天然蛋白質(zhì)資源， 目前對它的研究開發(fā)利用的進(jìn)展速

37、度很快，主要是因?yàn)樗匾淖饔?。膠原蛋白具有緊密的螺旋結(jié)構(gòu)從而顯示出很強(qiáng)的韌性和強(qiáng)度；氨基酸組成又使共具有優(yōu)良的成膜能力，它不僅可以作為保健食品、美容產(chǎn)品、包裝材料，還可以作為食品添加劑應(yīng)用在肉制品改良、冷凍食品、飲料、糕點(diǎn)以及乳制品等中[19]。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，膠原蛋白由于具有低免疫原性、纖維的再形成性、強(qiáng)的機(jī)械性能和生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)，作為生物材料廣泛的應(yīng)用。在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域中，膠原蛋白可制成膠原海綿、膠原膜、人工皮膚、固定化美酶載

38、體和膠囊等。膠原蛋白作為一種新型的材料，是一個(gè)正待開發(fā)的寶藏，隨著研究的不斷深入，將會(huì)有更廣闊的應(yīng)用前景。</p><p><b>　　主要參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 張虹，卓素珍，戴志遠(yuǎn).鮟鱇魚皮中膠原蛋白的提取及性質(zhì)研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2009，9（6），.</p><p>　　[2] 張俊杰, 段蕊,許曉靜等.

39、魷魚魚皮酶溶性膠原蛋白部分生化性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（12）57—59 </p><p>　　[3] 陳小娥, 方旭波, 鐘秋琴.安康魚皮中膠原蛋白的提取工藝研究[J].2007,3,131—133.</p><p>　　[4] 王學(xué)川，任龍芳，強(qiáng)濤濤，等.膠原蛋白的研究進(jìn)展及其在化妝品中的應(yīng)用[J].日用化學(xué)工業(yè)， 2005，35（6）388-391</p&

40、gt;<p>　　[5] 張培麗，愛梅，劉欣等. 淡水魚皮膠原蛋白提取工藝研究(Ⅰ) [J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32（12）150-153.</p><p>　　[6] [J] 周愛梅,張培麗,劉欣等. 淡水魚皮膠原蛋白提取優(yōu)化工藝研究(Ⅱ) 食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33（1），113—117.</p><p>　　[7] 丁卓平，劉振華，李仁冬等. 羅非魚魚皮膠

41、原蛋白提取條件的研究[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)　2006, 33 (4),190—192. [8] [J].</p><p>　　[8] 程波，吳潔，張玉蓉等。酶法提取人工養(yǎng)殖鱘魚皮中膠原蛋白的工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2009,30（3）1—4.</p><p>　　[9] 郭恒斌,曾慶祝. 酶法提取魷魚皮膠原蛋白工藝條件的研究[J]. 南方水產(chǎn),2004,2，(1),58—63.&l

42、t;/p><p>　　[10] 郭文宇, 邊清泉, 劉家琴等. 木瓜蛋白酶提取草魚皮膠原蛋白的工藝研究[J]. 皮革與化工,2009,26(1),34-36.</p><p>　　[11] 唐文婷. 木瓜蛋白酶提取魷魚皮膠原蛋白的工藝研究[J].四川食品與發(fā)酵，2008，44（5），32-34.</p><p>　　[12] 戶業(yè)麗, 吳潔2, 張瑞等. 酸法提取人工養(yǎng)

43、殖鱘魚皮中膠原蛋白工藝的研究 [J].食品科技，2008,209-212.</p><p>　　[13] 秦玉青,王慥,劉承初. 魷魚皮膠原蛋白的提取利用實(shí)驗(yàn)研究[J]. 　中醫(yī)研究　2002，15（1），20-21..</p><p>　　[14] 許慶陵, 郭恒斌, 曾慶祝. 魷魚皮膠原蛋白制備技術(shù)研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2008 ，9，29 ，（9），59-64.</p&

44、gt;<p>　　[15] 胡建平，吳琦，陳惠. 鰱魚鱗膠原蛋白的制備及性質(zhì)研究 [J]. 食品科技,2010 ,35 (1 )230-238.</p><p>　　[16] 鐘朝輝, 李春美, 顧海峰等. 草魚魚鱗酶溶性膠原蛋白的提取及基本特性 [J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2007年,26(2),91-94.</p><p>　　[17] 劉艷，劉章武，唐婧苗. 淡水魚鱗水解膠原

45、蛋白的酶法制備[J]. 食品研究與開發(fā), 2009 ,30 (6)99-103 </p><p>　　[18] 張海彬 ,王軍玲. 鰱魚鱗片膠原蛋白的提取[J]. 水　利　漁　業(yè),2008,28(2) 43-45.</p><p>　　[19] 黃煥，王欣，劉寶林等. 木瓜蛋白酶水解魚鱗膠原蛋白的工藝研究 [J]. 食品科學(xué)，2009,30（24）23-25.</p><

46、;p>　　[20] 曾嶸,楊忠華 ,王玉等. 水產(chǎn)廢棄物膠原蛋白的提取 [J]. 生物加工過程,2008,6(5)27-30.</p><p>　　[21] 王吰, 劉劍虹, 李可偉. 胃蛋白酶法提取草魚鱗膠原蛋白的工藝研究 [J]. 食品研究與開發(fā),2007,28(4)134-136.</p><p>　　[22] 華萍. 魚鱗膠原蛋白的酶法提取工藝研究[J]. 食品科技2008,

47、29-34.</p><p>　　[23] 曹俊. 魚鱗膠原蛋白的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)　2009, 36 (1) 41-44 .</p><p>　　[24] 劉慶慧,王彩理,劉從力. 魚鱗提取物延緩衰老作用研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 1999, 20 (1) : 75 - 79..</p><p>　　[25] Takeshi Nagaia,

48、 Yoko Araki, Nobutak Suzukia. Collagen of the skin of ocellate puffer fish(Takifugu rubripes)[J] Food Chemistry 78 (2002) :173–177</p><p>　　[26] Sitthipong Nalinanon, Soottawat Benjakul, Wonnop Visessanguan,

49、 Hideki Kishimura. Use of pepsin for collagen extraction from the skin of bigeye snapper (Priacanthus tayenus)[J] Food Chemistry 104 (2007) 593–601</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><

50、b>　　（20 屆）</b></p><p>　　胃蛋白酶提取烏賊皮中膠原蛋白的工藝研究</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　1前言1</b></p><p><b>　　2材料與方法1</b></p>

51、<p><b>　　2.1材料1</b></p><p>　　2.2儀器設(shè)備1</p><p><b>　　2.3方法2</b></p><p>　　2.3.1烏賊皮基本成分測定2</p><p>　　2.3.2蛋白酶活力的測定2</p><p&g

52、t;　　2.3.2.1試劑2</p><p>　　2.3.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2</p><p>　　2.3.2.3樣品測定2</p><p>　　2.3.2.4計(jì)算2</p><p>　　2.3.3膠原蛋白得率的測定2</p><p>　　2.3.3.1羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9]2</

53、p><p>　　2.3.3.2提取液中羥脯氨酸質(zhì)量的測定3</p><p>　　2.3.3.3膠原蛋白得率的計(jì)算3</p><p>　　2.3.4工藝流程3</p><p>　　2.3.5烏賊皮的預(yù)處理3</p><p>　　2.3.6單因素實(shí)驗(yàn)3</p><p>　　2.3.6

54、.1醋酸濃度的選擇4</p><p>　　2.3.6.2料液比的選擇4</p><p>　　2.3.6.3胃蛋白酶添加量的選擇4</p><p>　　2.3.6.4提取時(shí)間的選擇4</p><p>　　2.3.7正交實(shí)驗(yàn)4</p><p><b>　　3結(jié)果與討論4</b>

55、</p><p>　　3.1烏賊皮（原料）基本成分分析4</p><p>　　3.2胃蛋白酶活力的測定5</p><p>　　3.3羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制5</p><p>　　3.4酸濃度對烏賊皮中膠原蛋白得率的影響6</p><p>　　3.5料液比對烏賊皮中膠原蛋白提取率的影響6</p&

56、gt;<p>　　3.6胃蛋白酶的用量對烏賊皮中膠原蛋白提取率的影響7</p><p>　　3.7酶提時(shí)間對烏賊皮中膠原蛋白提取率的影響7</p><p>　　3.8正交實(shí)驗(yàn)8</p><p>　　3.9驗(yàn)證試驗(yàn)9</p><p><b>　　4小結(jié)9</b></p>&l

57、t;p><b>　　參考文獻(xiàn)11</b></p><p>　　摘要:膠原蛋白是構(gòu)成生物體最重要的結(jié)構(gòu)蛋白,在水生生物中含量很高。烏賊皮中粗蛋白含量達(dá)16.64%，約占烏賊皮干重的80%。本文研究了利用胃蛋白酶提取烏賊皮中膠原蛋白的工藝條件。對提取過程中酸濃度、料液比、酶濃度、提取時(shí)間等因素進(jìn)行了研究。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，做了正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胃蛋白酶提取烏賊皮中膠原蛋白的最佳

58、工藝條件為：在4℃下，酸濃度為0.1mol/l，料液比為1:20，加酶量1400U/g，提取時(shí)間為12h，在此條件下得膠原蛋白的得率為11.09％。</p><p>　　關(guān)鍵詞:胃蛋白酶;烏賊皮;膠原蛋白提取;羥脯氨酸</p><p>　　Abstract: Collagen is the most important structural protein in organisms. Cr

59、ude protein content is 16.64% in squid skin, accounting for 80% of it’s dry weight. It exists in the surface of all aquatic organisms. Squid skin collagen Extraction by pepsin is studied In this paper

60、.The extraction technology including acetic acid concentration, solid to liquid ratio, enzyme concentration, immersion time was discussed. Single factor experiments and orthogonal test showed that The parameters are as f

61、ollo</p><p>　　Keywords: pepsin; squid skin collagen extraction; hydroxyproline</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　膠原蛋白是構(gòu)成生物體最重要的結(jié)構(gòu)蛋白,在人體中是皮膚、血管、骨骼、軟骨及結(jié)締組織最主要的蛋白質(zhì)。膠原廣泛存在于從低等脊椎動(dòng)物

62、的體表面到哺乳動(dòng)物機(jī)體的一切組織中，膠原蛋白占哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白總量的25% -30% ,體重的6%[1]。</p><p>　　膠原蛋白用途廣泛,其制品已應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品、化妝品等眾多領(lǐng)域。如膠原護(hù)膚霜、膠原面膜、膠原美容口服片等系列產(chǎn)品,其內(nèi)服外用效果良好,滿足了當(dāng)前消費(fèi)者對功能性產(chǎn)品的強(qiáng)烈需求;目前在歐美國家,服用膠原產(chǎn)品進(jìn)行皮膚深層養(yǎng)護(hù)已成時(shí)尚[11]。據(jù)專家預(yù)測,我國的膠原熱潮也即將到來。膠原也是

63、人類皮膚的主要組成成分。人處于幼年時(shí),皮膚中膠原的含量高,隨著年齡的增長,其含量開始逐漸下降,導(dǎo)致皮膚漸漸喪失保濕功能,人體只有不斷合成新膠原才能保持皮膚健康且具有彈性。膠原蛋白的陰離子側(cè)鏈豐富,能吸附大量水分,維持皮膚的濕潤、彈性[2]。</p><p>　　牛和豬的皮、骨頭通常是膠原蛋白的主要來源，然而，牛海綿狀腦?。˙SE）、傳染性海綿狀腦?。═SE） 和口蹄疫（FMD）的爆發(fā)使得人們對陸生動(dòng)物來源的膠原蛋

64、白及其衍生產(chǎn)品的安全性產(chǎn)生恐慌[3]。另外，由于宗教因素，如猶太教和伊斯蘭教，從豬來源提取的膠原蛋白作為食物的組分，其應(yīng)用受到限制[2]。因此尋找可替代的新來源的膠原蛋白就顯得非常迫切[4]。</p><p>　　烏賊加工會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料,如烏賊皮、側(cè)鰭、內(nèi)臟、內(nèi)骨骼等,如果不進(jìn)行有效處理,不僅會(huì)造成環(huán)境的污染,而且會(huì)浪費(fèi)大量的寶貴資源。如能充分利用這些成分,不僅可提高烏賊加工的附加值,同時(shí)可減少環(huán)境污染,獲得

65、良好的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益[1]。而烏賊皮中膠原蛋白的含量很高，因此成為了可以代替豬、牛等陸生動(dòng)物的膠原潛在來源。</p><p>　　膠原蛋白的提取方法主要包括酶提法和酸提法，而酶提法的膠原蛋白得率比酸提法要大得多[5]。酸溶脹的魚皮膠原具有更加松散的結(jié)構(gòu)，從而更易被蛋白酶作用[6]。因此本文采用加酸輔助胃蛋白酶提取烏賊皮中膠原蛋白的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別對醋酸濃度、料液比（原料魚皮w/酸體積v）、加酶量、酶解時(shí)間幾

66、個(gè)因素做單因素實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇醋酸濃度、料液比（原料魚皮w/酸體積v）、加酶量、酶解時(shí)間四個(gè)因素，做四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，從而得出酸輔助胃蛋白酶提取烏賊皮中膠原蛋白的特點(diǎn)。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　材料</b></p><p>　　金烏賊(Sepia esc

67、ulenta Hoyle)，購買于寧波市莊市；</p><p>　　胃蛋白酶，美國aMResco公司，冷藏于冰箱中；其余化學(xué)試劑，均為分析純。</p><p><b>　　儀器設(shè)備</b></p><p>　　組織搗碎勻漿機(jī)DS-1 上海標(biāo)本模型廠</p><p>　　電子分析天平

68、 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司</p><p>　　DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司</p><p>　　冷凍高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司</p><p>　　T6-新銳可見分光光度計(jì)

69、 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司</p><p>　　數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥器101-2A 型 上海錦屏儀器儀表有限公司</p><p>　　凱氏定氮裝置，消化爐，馬福爐等。</p><p><b>　　方法</b></p><p><b>　　烏賊皮基本成分測定&l

70、t;/b></p><p>　　參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009系列（2003 年版），新鮮烏賊皮（金烏賊）的水分采用GB/T 5009.3-2003直接干燥法；灰分參照GB/T 5009.4-2003；蛋白質(zhì)采用GB/T 5009.5-2003第一法；總糖采用苯酚硫酸法測定。</p><p><b>　　蛋白酶活力的測定</b></p><p&

71、gt;<b>　　試劑</b></p><p>　　福林試劑(Folin試劑)；0.4 mol碳酸鈉溶液；0.4 mol三氯乙酸(T C A)溶液；2% 酪蛋白溶液；100 μg/mL酪氨酸溶液[7]。</p><p><b>　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制</b></p><p>　　分別吸取不同濃度酪氨酸1 mL，各加入0.4 m

72、ol碳酸鈉5 mL，再各加入已稀釋的福林試劑1 mL。搖勻置于水浴鍋中。40 ℃保溫發(fā)色20 min在660 nm波長測OD值。一般測三次，取平均值，同時(shí)做空白試驗(yàn)。</p><p><b>　　樣品測定</b></p><p>　　稱取酶粉0.100 g，加入pH 7.2磷酸鹽緩沖液定容至100mL，吸取此液5 mL，再用緩沖液稀釋至25 mL，即成5000倍的酶粉

73、稀釋液。取樣品稀釋液1 mL，置于40 ℃水浴中預(yù)熱2 min，再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1 mL，精確保溫10 min，時(shí)間到后，立即再各加入0.4 mol三氯乙酸2 mL，以終止反應(yīng)，繼續(xù)置于水浴中保溫20 min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心或過濾，然后另取濾液1 mL，再加0.4 mol碳酸鈉5 mL，已稀釋的福林試劑1 mL，搖勻，40 ℃保溫發(fā)色20 min后進(jìn)行光密度(OD)測定?？瞻自囼?yàn)測定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4

74、 mol三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白[7]。</p><p><b>　　計(jì)算</b></p><p>　　在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。</p><p>　　樣品蛋白酶活力單位(干基) = ×4×N×</p><p><b>　

75、　式中：</b></p><p>　　A —由樣品測得OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)(或OD值×K)；</p><p>　　4 —4 mL反應(yīng)液取出1 mL測定(即4倍)；</p><p>　　N —酶液稀釋的倍數(shù)；</p><p>　　10 —反應(yīng)10 min；</p><p>　　W

76、—樣品水分百分含量。</p><p><b>　　膠原蛋白得率的測定</b></p><p>　　膠原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、羥賴氨酸等，其中羥脯氨酸（Hydroxyproline，以下簡稱Hyp）和羥賴氨酸在其它蛋白中很少見[6]，為膠原蛋白所特有。通過測定羥脯氨酸的質(zhì)量，然后乘以相應(yīng)的系數(shù)就可以得到膠原蛋白的質(zhì)量[8]。</p>&l

77、t;p>　　羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9]</p><p>　　參考閆鳴艷[9]的方法繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，略有改變。</p><p>　　配置羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：精確稱取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品100mg，加入0.001mol/L鹽酸中溶解，稀釋并定容到100mL。取其中1 mL定容到100 mL容量瓶中，該為質(zhì)量濃度為10ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。</p><p>

78、　　準(zhǔn)確吸取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作于1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別用蒸餾水定容到10 mL，得到濃度分別為1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL，4μg/mL，5μg/mL的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。</p><p>　　取上述標(biāo)準(zhǔn)液各1ml于試管中，以0.001mol/L的鹽酸溶液作為空白液，在標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白液中分別加入1ml的氯胺T溶液，混勻，室溫下靜置10min，再加入1ml的高氯酸溶液，混勻，室溫下

79、靜置5min，最后加入對二甲基苯甲醛溶液1ml，混勻，60℃加熱20min進(jìn)行顯色反應(yīng)，至于冷水中冷卻。以空白液調(diào)零，測定560nm處得吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　提取液中羥脯氨酸質(zhì)量的測定</p><p>　　吸取5mL提取液于具塞試管中，加入6mol/L的鹽酸5mL，封口后于130℃下水解4 h。冷卻后取出，用蒸餾水定容至10mL，脫色，濾紙過濾，取濾液1mL，調(diào)pH至

80、中性后定容至50mL[9]。</p><p>　　吸取1mL樣品溶液，按羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，以空白調(diào)零，測定待測樣品的吸光度。由羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出樣品液中羥脯氨酸含量。</p><p>　　提取液中羥脯氨酸質(zhì)量按下式計(jì)算：</p><p>　　羥脯氨酸質(zhì)量（mg）=h×10-３×稀釋倍數(shù)×V提</p><

81、p>　　式中：h－標(biāo)準(zhǔn)曲線上相對應(yīng)的羥脯氨酸的含量（μg/mL）； V提－提取液的總體積（mL）。 </p><p><b>　　膠原蛋白得率的計(jì)算</b></p><p>　　膠原蛋白質(zhì)量（%）=羥脯氨酸質(zhì)量（mg）×系數(shù)</p><p>　　膠原蛋白得率（%）=提取液膠原蛋白質(zhì)量（g）/原料質(zhì)量（g）×100<

82、;/p><p>　　由于HYP含量與膠原蛋白的含量是呈正相關(guān)性, 將測定的HYP含量乘以相應(yīng)的系數(shù)即可得出膠原蛋白的含量，本文中該系數(shù)取11.1[10]。</p><p><b>　　工藝流程</b></p><p>　　剪碎的烏賊皮→脫脂→除雜蛋白→勻漿→加入酸溶液→加入胃蛋白酶→酶解→沸水浴加熱10 min，使酶失活→離心（8000 r

83、3;min-1）20 min→取上清液定容，測定提取液中羥脯氨酸質(zhì)量，計(jì)算膠原蛋白得率。</p><p><b>　　烏賊皮的預(yù)處理</b></p><p>　　（1） 新鮮烏賊皮從烏賊體剝下后，仔細(xì)地將皮下肉、脂肪及結(jié)締組織剔除，流水沖洗，室溫晾干后剪碎，冷凍貯藏于冰箱中。實(shí)驗(yàn)前取出冷凍的碎魚皮，室溫下解凍晾干。</p><p>　　（2）脫

84、脂：稱量10g碎魚皮，放入含1%（V:V）H2O2的0.01mol/L氫氧化鈉溶液(1：20,W/V)中，4℃下浸泡3h，之后水洗至中性，2000r/min離心20min，棄去濾液，取沉淀。</p><p>　　（3）除雜蛋白：將脫脂后烏賊皮（即沉淀）放入0.2mol/L氯化鈉溶液(1：30,W/V)中，4℃下浸泡6h，每3h更換一次溶液，之后水洗，2000r/min離心20min，棄去濾液，殘?jiān)谩?lt;/

85、p><p>　?。?）所得殘?jiān)铀?00g，間歇?jiǎng)驖{10min，制成勻漿液。</p><p><b>　　單因素實(shí)驗(yàn)</b></p><p>　　分別吸取10.00g勻漿液到錐形瓶中，加入適量的胃蛋白酶和酸溶液，于一定溫度下提取一定時(shí)間，完成后沸水浴10min滅酶，靜止冷卻，8000r/min離心20min，取上清液定容，測定提取液中羥脯氨酸質(zhì)量

86、，計(jì)算膠原蛋白得率。試驗(yàn)所有提取條件的選擇都以等量魚皮提取后所得膠原蛋白得率作為指標(biāo)。</p><p>　　由于在低溫下（4℃），胃蛋白酶更傾向于切除膠原蛋白的非螺旋結(jié)構(gòu)的端肽，因而不會(huì)造成膠原結(jié)構(gòu)的深度破壞。一般來說，胃蛋白酶活性在低PH條件下增強(qiáng)。而在室溫(26–28℃)下，胃蛋白酶表現(xiàn)出更高的活性而且能夠隨意的切除魚皮中溶脹的膠原蛋白分子，但膠原分子結(jié)構(gòu)在深度反應(yīng)條件下被破壞[11]。因此，實(shí)驗(yàn)酶解溫度都在

87、4℃下進(jìn)行。</p><p><b>　　醋酸濃度的選擇</b></p><p>　　加酶量為1400 U/g胃蛋白酶，料液比為1:10，實(shí)驗(yàn)在4℃進(jìn)行，提取12h。醋酸濃度分別為0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L和2.0mol/L。</p><p><b>　　料液比的選擇</b></p>

88、<p>　　加酶量為1400 U/g胃蛋白酶，醋酸濃度0.5mol/L，實(shí)驗(yàn)在4℃進(jìn)行，提取12h。料液比（烏賊皮：酸溶液，W:V）分別為1:5、1:10、1:15 、1:20和1:25。</p><p>　　胃蛋白酶添加量的選擇</p><p>　　醋酸濃度0.5mol/L，料液比為1:10，實(shí)驗(yàn)在4℃進(jìn)行，提取12h。加酶量分別為700U/g、1400U/g、2100U/g

89、和2800U/g。</p><p><b>　　提取時(shí)間的選擇</b></p><p>　　加酶量為1400 U/g胃蛋白酶，醋酸濃度0.5mol/L，料酸比為1:10，實(shí)驗(yàn)在4℃進(jìn)行。提取時(shí)間分別為6h、12h、24 h、36 h和48 h。</p><p><b>　　正交實(shí)驗(yàn)</b></p><p

90、>　　根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取酸濃度（A）、料液比(B)、胃蛋白酶用量（C）和酶解時(shí)間(D)為試驗(yàn)因子，以膠原蛋白的得率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行提取，對酶法提取烏賊皮中膠原蛋白的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化(表1)，得到酶法提取的最佳工藝條件。</p><p>　　表1：正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表</p><p>　　Table 1：Factors and levels of ort

91、hogonal test</p><p><b>　　結(jié)果與討論</b></p><p>　　烏賊皮（原料）基本成分分析</p><p>　　表2 烏賊皮一般成分表（以濕重計(jì)）</p><p>　　Table2 Proximate composition of squid skin</p><p>

92、;　　從表2中可看出，烏賊皮雖是水產(chǎn)品加工的廢棄物，但是其中含有豐富的蛋白質(zhì)，粗蛋白含量達(dá)16.64%，約占烏賊皮干重的80%。</p><p><b>　　胃蛋白酶活力的測定</b></p><p>　　所得酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y =0.0115x +0.0095, 相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9987,其中: y為吸光度; x為酪氨酸濃度(ug/ml) ,標(biāo)準(zhǔn)曲

93、線見圖1。</p><p>　　圖1 胃蛋白酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Fig.1 The standard curves of pepsin activity</p><p>　　根據(jù)福林（Folin）法操作說明與酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得胃蛋白酶活力為14000U/g。</p><p>　　羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制</p>

94、<p>　　參照文獻(xiàn)[9]測定不同濃度的羥脯氨酸的A560值，根據(jù)可見分光光度計(jì)測定的數(shù)值，繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2。用計(jì)算機(jī)擬合出標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為Y=0.0546X-0.0071，Y為吸光度值，X為羥脯胺酸的濃度（μg/mL）。羥脯氨酸濃度與吸光度之間呈直線相關(guān)（R2=0.9994）。因此，由此標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算羥脯氨酸濃度準(zhǔn)確可靠。通過該曲線方程，可得到羥脯氨酸含量，從而最終通過計(jì)算得到膠原蛋白得率[13]。</p&

95、gt;<p>　　圖2 羥脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Fig.2 The standard curves of hydroxyproline</p><p>　　酸濃度對烏賊皮中膠原蛋白得率的影響</p><p>　　按照以下條件，分別對等量的烏賊皮勻漿液進(jìn)行提取。加酶量為1400 U/g胃蛋白酶，料液比為1:10，實(shí)驗(yàn)在4℃進(jìn)行，提取12h

96、。醋酸濃度分別為0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、2.0mol/L。計(jì)算提取液中膠原蛋白得率，結(jié)果如圖3所示。</p><p>　　圖3：不同酸濃度對烏賊皮中膠原蛋白提取的影響</p><p>　　Fig3：Effect of different t acid concentration on extraction of collagen from Squid skin

97、</p><p>　　由圖3可知，乙酸濃度為0.5mol/L時(shí)，膠原蛋白得率最高，當(dāng)酸濃度大于0.5mol/l時(shí)，膠原蛋白提取率隨著酸濃度的增大而減少，因此，提取烏賊皮中膠原蛋白的最佳酸濃度為0.5mol/L。</p><p>　　料液比對烏賊皮中膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　按照以下條件，分別對等量的烏賊皮勻漿液進(jìn)行提取。加酶量為1400 U/g胃蛋白

98、酶，醋酸濃度0.5mol/L，實(shí)驗(yàn)在4℃進(jìn)行，提取12h。料液比（烏賊皮：酸溶液，W:V）分別為1:5、1:10、1:15、1:20和1:25。計(jì)算提取液中膠原蛋白得率，結(jié)果如圖4所示。</p><p>　　圖4不同料液比對烏賊皮中膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.4 Effect of different Solid-liquid ratio on extraction

99、of collagen from Squid skin</p><p>　　由圖4可知，固液比較小時(shí)，烏賊皮在溶液中密度太大，不能完全提取，提取率低，隨著料液比逐漸增大，膠原蛋白提取率整體呈現(xiàn)出上升的趨勢，而當(dāng)料液比到達(dá)1:20后，提取率開始減少，因此，烏賊皮中膠原蛋白提取率的最佳料液比選擇1：20。</p><p>　　胃蛋白酶的用量對烏賊皮中膠原蛋白提取率的影響</p>

100、<p>　　按照以下條件，分別對等量的烏賊皮勻漿液進(jìn)行提取。醋酸濃度0.5mol/L，料液比為1:10，實(shí)驗(yàn)在4℃進(jìn)行，提取12h。加酶量分別為700U/g、1400U/g、2100U/g和2800U/g。計(jì)算提取液中膠原蛋白得率，結(jié)果如圖5所示。</p><p>　　圖5 不同胃蛋白酶用來對烏賊平中膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.5 Effect of dif

101、ferent pepsin concentration on extraction of collagen from Squid skin</p><p>　　由圖5所示，隨胃蛋白酶用量的增加，膠原蛋白的提取率也增加， 但胃蛋白酶用量超過1400U/g 后，膠原蛋白提取率增加很緩慢。因此，從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，胃蛋白酶的最佳用量為1400U/g 較為合適。</p><p>　　酶提時(shí)間對烏賊皮

102、中膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　按照以下條件，分別對等量的烏賊皮勻漿液進(jìn)行提取。加酶量為1400 U/g胃蛋白酶，醋酸濃度0.5mol/L，料酸比為1:10，實(shí)驗(yàn)在4℃進(jìn)行。提取時(shí)間分別為6h、12h、24 h、36 h和48 h。計(jì)算提取液中膠原蛋白得率，結(jié)果如圖6所示。</p><p>　　由圖6 可知，膠原蛋白提取率隨著浸提時(shí)間的增加而增大，但在12h內(nèi)，隨浸提時(shí)間延長，

103、膠原蛋白提取率增加較快，而超過12h后，提取率的增加變得很慢，因而， 以1400U/g 酶蛋白酶—0.5 mol/L 的乙酸為浸提劑，1:10的料液比條件下，提取時(shí)間12h為最佳。</p><p>　　圖6 不同浸提時(shí)間對烏賊皮中膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.6 Effect of different immersion time on extraction of co

104、llagen from Squid skin</p><p><b>　　正交實(shí)驗(yàn) </b></p><p>　　根據(jù)單因素酶解的試驗(yàn)結(jié)果，選取4因素3水平正交組合試驗(yàn)L9(34),確定酶提烏賊皮中膠原蛋白的最佳工藝條件。選取胃蛋白酶用量（A），酶解時(shí)間(B)，提取時(shí)間（C）和原料的固液比(D)為因素，每個(gè)因素三個(gè)水平，在4℃下進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)行酶法提取工藝研究，測定

105、了9 組胃蛋白酶水解液的HYP含量，結(jié)果如表3所示。結(jié)果見表3。</p><p>　　(1) 根據(jù)極差確定因素的主次順序：</p><p>　　由表5.4得出實(shí)驗(yàn)極差因素C>D>B>A，說明影響因素排列依次為加酶量>酶解時(shí)間>料液比>酸濃度。</p><p>　　(2) 較佳工藝的確定:</p><p>　

106、　在該試驗(yàn)中， HYP含量越大越好，所以應(yīng)挑選每個(gè)因素的K1、K2、K3中對應(yīng)的那個(gè)水平，由于：</p><p>　　A因素系列：K1> K2> K3</p><p>　　B因素系列：K2> K1> K3</p><p>　　C因素系列：K3> K2> K1</p><p>　　D因素系列：K3> K

107、2> K1</p><p>　　對于對于C因素（酶濃度）和D因素（酶解時(shí)間），雖然都是K3>K2，但實(shí)際二者相差不大，考慮經(jīng)濟(jì)因素，因此選C2和D2更優(yōu)；所以，用酸輔助胃蛋白酶從烏賊皮提取膠原蛋白的較佳工藝為A1B2C2D2，即在4℃酶解溫度下，酸濃度為0.1mol/l，料液比為1:20，加酶量1400 U/g，酶解時(shí)間12h。</p><p>　　表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)

108、設(shè)計(jì)與結(jié)果</p><p>　　Table.3 L9(34) orthogonal design and results</p><p><b>　　驗(yàn)證試驗(yàn)</b></p><p>　　為檢驗(yàn)正交法所得結(jié)果的可靠性，采用上述最優(yōu)改性條件進(jìn)行酸輔助胃蛋白酶提取烏賊皮中膠原蛋白實(shí)驗(yàn)，最佳工藝參數(shù)選取為在4℃酶解溫度下，酸濃度為0.1mol/l，

109、料液比為1:20，加酶量1400 U/g，酶解時(shí)間12h，膠原蛋白實(shí)際得率為11.09%，表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。</p><p><b>　　小結(jié)</b></p><p>　　經(jīng)醋酸處理的魚皮，在溶脹之后具有了更加松散易滲的結(jié)構(gòu)，因此，胃蛋白酶滲入魚皮基質(zhì)的能力增強(qiáng)了，胃蛋白酶提取膠原蛋白能力也就增強(qiáng)了，因此醋酸輔助提取胃蛋

110、白酶的膠原蛋白得率比單獨(dú)的酸法提取或酶法提取的膠原得率要高[11]。</p><p>　　從單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，影響胃蛋白酶法提取膠原蛋白的影響因素的幾個(gè)因素排列依次為加酶量>酶解時(shí)間>料液比>酸濃度。利用酸輔助胃蛋白酶提取烏賊皮中膠原蛋白的最佳工藝為：在4℃酶解溫度下，0.1 mol/L 的乙酸，胃蛋白酶量1400 U/g，提取時(shí)間為12h，料液比為1∶20。在此條件下獲得的膠原蛋

111、白得率為11.09%。</p><p>　　本文利用醋酸輔助胃蛋白酶提取烏賊皮中膠原蛋白，為其他研究人員后續(xù)的研究提供一定的數(shù)據(jù)支持，若投入產(chǎn)業(yè)化，不僅可提高烏賊加工的附加值,同時(shí)可減少環(huán)境污染,獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　張虹,卓素珍,戴志遠(yuǎn). 鮟鱇魚皮中膠原蛋白的提取及性

112、質(zhì)研究[J]中國食品學(xué)報(bào),2009,9（6）：34-39.</p><p>　　陳勝軍，曾名勇，董士遠(yuǎn). 水產(chǎn)膠原蛋白及其活性肽的研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2004，（6）：44-46.</p><p>　　吳丹，康懷彬，肖楓. 魚皮膠原蛋白研究進(jìn)展[J]. 肉類研究，2007,（6）:23-25. </p><p>　　丁卓平，劉振華，李仁冬，朱衛(wèi)欽. 羅非魚