酶解法提取牛皮膠原蛋白的條件優(yōu)化【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　食品質量與安全</b></p><p>　　酶解法提取牛皮膠原蛋白的條件優(yōu)化</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><

2、;p>　　膠原蛋白，主要存在于動物的皮、骨、軟骨、牙齒、肌腱、韌帶和血管中，是結締組織極重要的結構蛋白。由于膠原蛋白具有良好的物理性能和生物學特性，因而其被廣泛的應用于化工、食品、醫(yī)學、生物材料以及農業(yè)等諸多領域。因此，膠原蛋白的提取一直是研究的熱點。</p><p>　　目前國際上已開發(fā)出許多膠原保健品和功能性膠原生物材料。相對于我國，其在膠原蛋白的基礎研究上已經具有一些優(yōu)勢并擁有一定的國際專利，而且部分

3、已經投入市場，形成一定的市場規(guī)模。而我國的高質量膠原蛋白基礎研究還有差距，有關這方面的核心專利技術不多。</p><p>　　但就目前的消費趨勢來看，我國膠原蛋白的需求量逐漸增加，特別是隨著人們對飲食和健康的不斷重視，因此市場前景較為關闊。另一方面在肉制品和制革加工過程中含有豐富膠原物質的副產物（皮、內臟、肉骨頭）利用的附加值很低。這樣既浪費資源又污染環(huán)境，利用這些廢棄物生成膠原蛋白實現資源的合理和有價值的利用，

4、實現經濟和社會效益的雙贏。</p><p>　　本實驗的以牛肉制品的下腳料——牛皮為原料，利用酶解法提取膠原蛋白，同時通過試驗條件的優(yōu)化，得到較優(yōu)的提取條件，為今后的進一步研究提供參考。</p><p>　　研究的基本內容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　基本內容：</b></p><p>　　對牛皮成分

5、的測定：主要測其水分、脂肪、粗蛋白、膠原蛋白等。</p><p>　　酶制劑的選擇和復合：選擇兩種膠原蛋白提取率比較高的酶，然后按一定比例進行復合試驗。</p><p>　　研究不同實驗條件對膠原蛋白提取率的影響：通過對加酶量、水解pH、水解溫度、水解時間、固液比等因素進行單因素試驗，并在此基礎上進行正交試驗得出優(yōu)化的工藝條件。</p><p><b>　

6、　擬解決的問題：</b></p><p>　　如何選擇合適的比例對兩種單酶進行復合。</p><p>　　如何提高膠原蛋白的提取率。</p><p>　　研究的方法與技術路線：</p><p><b>　　研究的方法：</b></p><p>　　1、牛皮成分測定：水分測定采用直接干燥

7、法；脂肪測定采用索式提取法；蛋白質測定采用凱式定氮法；膠原蛋白的含量測定采用羥脯氨酸法</p><p>　　2、酶制劑的酶活力測定：采用福林酚法。</p><p>　　3、膠原蛋白的提?。?lt;/p><p>　?、蓬A處理：去脂采用丙酮法，去除其他非膠原成分采用5%的NaCl。</p><p>　?、颇z原蛋白測定：采用羥脯氨酸測定法。</p

8、><p>　　4、條件優(yōu)化方面：采用單因素實驗法和正交實驗法</p><p><b>　　技術路線：</b></p><p>　　牛皮→預處理→酶提→測定</p><p>　　研究的總體安排與進度：</p><p>　　1、2010年10月至2011年12月：實驗前的準備工作；查閱相關的文獻，完成開題

9、報告、任務書及文獻綜述。</p><p>　　2、2011年1月至2011年4月：實驗研究階段。</p><p><b>　?、艑εＦこ煞值臏y定</b></p><p>　?、泼钢苿┑倪x擇和復合</p><p>　　⑶研究不同實驗條件對膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　3、2011年4月至

10、2011年5月：整理實驗階段，并完成畢業(yè)論文。</p><p><b>　　主要參考文獻：</b></p><p>　　[1]廖艷陽.膠原蛋白的研究進展[J].長沙大學學報,2009,23(5):36～38</p><p>　　[2]Kharagpur. Fish collagen: A Potential Material For Biome

11、dical Application [J]IEEE,2010, 34～38</p><p>　　[3]王麗珍、黃素珍.膠原蛋白的研究進展[J].肉類研究,2010,131:16～22</p><p>　　[4]郭文宇、代敏、楊麗紅等.水生動物與陸生動物皮膠原特性及應用前景[J].中國皮革,2007,36(17):55～57</p><p>　　[5]郭恒斌、曾慶祝.

12、水產膠原蛋白的功能特性及其制備與應用[J].農產食品科技,2007,1(3):46～50</p><p>　　[6]郭玉華、劉揚瑞、李鈺金.魚類膠原蛋白及膠原活性多肽的研究進展[J].中國食品添加劑,2010,3:175～179</p><p>　　[7]肖高、施亦東、陳衍夏.膠原蛋白的提取及其對紡織材料的改性研究[J].絲綢,2010,2:5～9</p><p>

13、　　[8]胡立新、程驕、占穩(wěn)等.魚下角料中膠原蛋白的提取及應用[J].化學與生物工程,2009,26(2):7～9</p><p>　　[9]金桂芬、裘俊紅.海蜇膠原蛋白優(yōu)化提取條件的研究[J].浙江化工,2008,39(7):5～10</p><p>　　[10]周玉惠、頁正濤、肖立芳等.豬皮膠原蛋白的提取及其結構表征[J].湖北大學學報,2008,30(3):287～289</p

14、><p>　　[11]王川、李燕、馬志英等.幾種酶法從豬皮中提取膠原蛋白的對比研究[J].食品科學,2007,28(1):201～205</p><p>　　[12]肖世佳、但年華、曾睿等.從動物皮中提取膠原蛋白的方法[J].西部皮革,2009,31(15):17～21</p><p>　　[13]劉霞.魚鰭和魚鱗中膠原蛋白的提取[J].湖南農機,2008,3:146～

15、147</p><p>　　[14]吳緹、陳舜勝.魚皮膠原蛋白的制備及性能研究[J].內陸水產,2008,9:34～37</p><p>　　[15]鐘朝輝、李春美、顧海峰等.草魚魚鱗酸溶性膠原蛋白的提取及基本特性[J].水產科學,2007, 26(3):91～94</p><p>　　[16]陳小娥、方旭波、鐘秋琴.安康魚皮中膠原蛋白的提取工藝[J].食品工業(yè)科技

16、,2007, 28(3):131～133</p><p>　　[17]王晨、吳暉、李曉鳳等.胃蛋白酶酶解提取雞骨膠原蛋白工藝的研究[J].現代食品科技,2008, 24(12):1300～1303</p><p>　　[18]Defu Li, Changdao Mu, Sumei Cai e.at. Ultrasonic irradiation in the enzymayic extra

17、ction of collagen[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2007, 16:605～609</p><p>　　[19]盧曉林.膠原蛋白在醫(yī)學中的應用研究現狀[J].口腔醫(yī)學研究,2009, 15(6):806～808</p><p>　　[20]Chi H.Lee. Anujsingla, Yugyung Lee. Biomedical applic

18、ation of collagen [J].Internet of Pharmaceutic,2001, 221:1～22</p><p>　　[21]王丹.膠原蛋白在食品工業(yè)中的應用[J].農產食品科技,2009, 3(2):48～50.54</p><p>　　[22]李興武、章黎黎.膠原蛋白的改性研究及在食品工業(yè)中的應用[J].肉類研究,2009, 11:80～84</p>

19、;<p>　　[23]曹榮安、李浩、李良玉.膠原蛋白的生理功能特性及其應用[J].肉類工業(yè),2010, 345:7～9</p><p>　　[24]蘇媛媛、劉飛宏.魚鱗中膠原蛋白的利用價值[J].企業(yè)技術開發(fā),2009:154</p><p>　　[25]王志杰、彭立新.膠原蛋白的提取及其配吵紙張的物理性能[J].紙和造紙,2006, 25(5):35～36</p>

20、;<p>　　[26]王元蓀.從牛制革廢皮邊角料中提取未變性天然膠原[J].明膠科學與技術,2008, 28(3):125～128</p><p>　　[27]張瑩、魏玉娟.廢革屑提取膠原蛋白的研究[J].中國皮革,2008, 37(5):36～40</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b

21、>　　食品質量與安全</b></p><p>　　酶解法提取膠原蛋白的研究進展</p><p>　　摘 要：膠原蛋白是一種重要的功能性多糖蛋白質。因具有良好的物理性能和生物學特性在醫(yī)學、食品、美容保健等許多領域有著廣泛的應用。因此膠原蛋白的提取一直是研究的熱點。而酶提取法是目前比較理想的手段。本文介紹了酶提取法相較其他幾種提取法的優(yōu)點，并闡述了酶提取法的工藝流程以及在工藝

22、條件上的研究，最后指出了目前膠原蛋白的應用狀況。</p><p>　　關鍵詞：膠原蛋白；提??；酶解法；應用前景</p><p>　　Research Progress About The enzymatic Extraction Of Collagen</p><p>　　Abstract: Collagen protein is a kind of importa

23、nt functional polysaccharide protein. Due to its favorable physical and biological characteristics, collagen has a wide range of applications in many areas. Therefore the collagen extraction has been the research focus.

24、And enzyme extraction is the relatively ideal means. This essay expounds the advantages of enzymatic extraction of collage compared with other extraction methods. Then introduces the enzymatic extraction process and the

25、research in t</p><p>　　Key word: collagen; extraction; enzymatic extraction; application prospects</p><p><b>　　1前言</b></p><p>　　膠原蛋白是哺乳動物內含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質，占人體內蛋白質總量的25%~3

26、0%，相當于體重的6%。膠原蛋白是一種重要的功能性多糖蛋白質，與細胞再生、分化、運動、免疫、關節(jié)潤滑、血壓抑制、傷口愈合、衰老及疾病等有極其密切的關系。同時由于膠原蛋白獨特的三重螺旋結構，使其分子結構非常穩(wěn)定，并具有低免疫原性和良好的生物相容性。結構決定性質，性質決定用途，膠原蛋白的結構的多樣性和復雜性決定其在許多領域的重要地位。其應用領域涉及醫(yī)藥、化妝品、食品等多個分支[1～3]。從19世紀40年代，Orekjovich等應用枸椽酸緩

27、沖液從大鼠皮膚中溶解出與角蛋白、彈性蛋白同類的不溶性蛋白-膠原蛋白，翻開了膠原研究的篇章[4]以來到現在，對膠原蛋白的研究不斷增多。而膠原蛋白的提取一直是研究的熱點。</p><p>　　2膠原蛋白的提取方法研究</p><p>　　2.1提取方法的比較</p><p>　　膠原蛋白的提取與純化的目標是盡量使膠原提取的產率、純度更高，并且使所提取的膠原能滿足不同領域

28、的要求。迄今為止，依據提取介質的不同，膠原蛋白的提取方法可分為五類，即熱水浸提法、酸法、堿法、鹽法以及酶法等[5]。</p><p>　　熱水提取法是原料經過各種預處理后，在一定條件下用熱水抽提而得到水溶性膠原蛋白的方法。此法提取率高，但是所得的膠原蛋白已經不具有膠原蛋白的三螺旋空間結構。酸法提取主要采用低離子濃度酸性條件浸漬處理原料，從而破壞分子間的鹽堿和希夫堿，而引起纖維膨脹、溶解。酸法提取比較迅速而且徹底，

29、但色氨酸全部被破壞，且產品得率低，設備腐蝕嚴重，污染重。堿法提取是用堿溶液預處理后的材料，從而達到提取膠原蛋白的目的。堿法提取也較迅速徹底，但是含羥基和硫基的氨基酸全部被破壞，且產生消旋作用，很難保留膠原蛋白的三股螺旋結構。因此，現代工業(yè)一般不采用此種方法。鹽法是利用各種不同的鹽在不同的濃度下提取鹽溶性膠原蛋白的方法。但是其溶解和分級受中性鹽效應影響。有的鹽可以維持膠原蛋白的穩(wěn)定性，而有的則可降低其構象穩(wěn)定性，從而對提取天然膠原蛋白很不

30、利。</p><p>　　酶法提取是利用各種不同的酶主要是各種蛋白酶在一定的外界環(huán)境條件下提取膠原蛋白。由于膠原蛋白的三股螺旋結構對胃蛋白酶具有相當的穩(wěn)定性。因此酶提取法對膠原蛋白破壞性小，能更好更完全地得到活性蛋白，同時其具有較高的回收率，無環(huán)境污染，。利用該方法提取膠原蛋白不僅能滿足一些領域對膠原蛋白結構的特殊要求，而且符合當今生態(tài)化提取膠原蛋白的要求 [6~8]。金桂芬等人[9]對于海蜇膠原蛋白優(yōu)化提取條件

31、的研究中，發(fā)現采用酸法和酶法分別提取膠原蛋白，發(fā)現酶法提取可獲得較高含量的膠原蛋白，并且膠原蛋白的純度較高。周玉慧[10]等人采用較簡單的酶法從豬皮中提取膠原蛋白，通過SDS-PAGE凝膠電泳、紫外光譜定性分析表明膠原蛋白具有完整的三螺旋結構，即具有生物活性。如今生物技術水平不斷地提高，酶制劑來源廣泛，活性不斷提高，價效比也大幅度地降低，在酶法提取膠原蛋白顯示了其他方法無法比擬的優(yōu)越性。因此，目前用酶法提取膠原蛋白是比較理想的手段。&l

32、t;/p><p><b>　　2.2酶的選擇</b></p><p>　　能用于提取膠原蛋白的酶有很多。按照來源上可以分為植物蛋白酶（如菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶等）、動物蛋白酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶）、微生物蛋白酶（如枯草桿菌蛋白酶等）。根據酶的性質，又可以分為中性蛋白酶、酸性蛋白酶及堿性蛋白酶。由于各種酶之間存在差異性，單用一種酶往往會存在一些不足。王川等人

33、[11]用胰酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶三種酶從豬皮中提取膠原蛋白的研究中發(fā)現，胰酶得率最高，可操作性強，但相對其他兩種結構破壞較嚴重；胃蛋白酶的結構保持了最大的完整性，分子量在10萬Da左右。但得率是三種酶中最低的。木瓜蛋白酶的得率和結構都介于兩者之間[9]。因此在實際操作中，大多數采用復合酶來提取膠原蛋白。</p><p>　　3酶法提取膠原蛋白的工藝條件研究</p><p>　　3.1酶

34、法提取膠原蛋白的工藝流程</p><p>　　酶法提取膠原蛋白的一般工藝為：預處理→酶解→鹽析→透析→冷凍干燥[12]。預處理一般是除去皮源中不同雜志，如鈣物質、脂肪等，以便后續(xù)操作，得到更多更純的膠原蛋白。酶解過程主要是在預處理的原料中加入酶制劑等，在一定的反應條件，酶解一定時間的，將原料中膠原蛋白提取的過程。在這個過程中，由于原料的性質不同或者所選用的酶特性，可能在加入酶制劑的同時在加入其它的輔助試劑，例如采

35、用胃蛋白酶做為酶制劑中，需要加入酸性介質，一般采用加入乙酸。劉霞[13]對魚鰭和魚鱗中膠原蛋白的提取中，采用檸檬酸做為介質，并與乙酸做比較，發(fā)現檸檬酸的提取效果更好。而后面的幾個步驟主要是對膠原蛋白進行分析、純化和保存。一般是通過加氯化鈉進行鹽析，然后用將得到的蛋白液移入透析袋進行透析，最后對得到的膠原蛋白進行冷凍干燥進行保存。在這個過程也包括一些過濾、離心、溶解等過程。</p><p>　　3.2酶法提取膠原蛋

36、白的工藝條件</p><p>　　采用酶法提取膠原蛋白時，必須嚴格控制提取條件。影響酶提取法的因素很多，主要包括酶的用量、水解pH、水解時間、水解溫度等[8]。例如水解溫度對膠原蛋白的影響[12，14]。目前國內采用酶法提取膠原蛋白時的水解溫度基本在50℃以上或4℃以下，而膠原蛋白在37～38℃以上就會變性，生產明膠[11]。鐘朝輝[15]等人在研究草魚魚鱗酸溶性膠原蛋白的提取及基本特性中發(fā)現用DSC測定草魚魚鱗

37、PSC冷凍干品的變性溫度時，PSC在37.1℃時存在吸熱峰，表明此時膠原蛋白結構被破壞而發(fā)生變性。故較高溫度下的提取物為變性膠原，其進一步應用受到限制。低溫下雖然有助于膠原結構的完整，但酶解時間長[12]。而膠原的結構對于其在醫(yī)學、保健等方面的應用有很大的影響，但在造紙工業(yè)以及制革工業(yè)等領域，膠原蛋白的結構對其影響相對較小。因此，溫度的選擇要根據膠原蛋白產品的最終用途相結合。同時又由于這些因素既是相輔相成，又是有主次的影響之分，所以在研

38、究中需要總體考慮。也因為其的復雜性，對酶提法的工藝條件優(yōu)化成為很多學者的研究對象。</p><p>　　陳小娥等人[16]在對安康魚皮中膠原蛋白的提取工藝研究中，進行了最佳酶處理條件的確定，主要是對最佳胃蛋白酶添加量、最佳料液比、最佳酶解時間、最佳酶解溫度的確定，通過單因素實驗和正交實驗最后得到安康魚皮膠原蛋白的最佳處理條件為：胃蛋白酶質量分數為1%，料液比為1:10，酶解時間為6h，酶解溫度為5℃，最后平均提取

39、率為11.01%，純度為96.5%。王晨[17]等人以干雞骨粉為原料，研究了用胃蛋白酶提取膠原蛋白的酶法提取工藝。得出的最佳酶解工藝為：加酶量150U/g，pH值為1.7、37℃條件下處理120min,然后在固液比6:1的情況下用水抽提5h.在上述條件下，提取率可達18.4%。</p><p>　　此外，一些研究者還通過添加在酶提取中加入其他的處理來提高膠原蛋白的提取率等。Defu Li等人[18]在研究超聲波對

40、酶提取提取膠原蛋白的影響中發(fā)現，利用超聲波照射后，膠原蛋白的提取率明顯提高，大約是未進行超聲波照射的124%，而且縮短了提取的時間。</p><p>　　4膠原蛋白的應用前景</p><p>　　膠原蛋白由于無毒、無致畸、無突變性能，生物相容性好，并在體內可以降解成無毒天然產物，在醫(yī)學領域應用前景關闊，目前主要作為凝血材料、組織工程材料、藥物載體材料和充填材料等[19~20]。同時膠原蛋白

41、具有緊密的螺旋結構從而顯示出很強的任性和強度，氨基酸組成又使其具有優(yōu)良的成膜能力，在食品行業(yè)保健行業(yè)被廣泛應用，主要作為功能保健食品、食品添加劑、食品包裝以及涂層材料等[21~22]。而且從動物皮重提取的膠原蛋白中還含有透明質酸、硫酸軟骨等蛋白多糖，它們含有大量極性集團，是保濕因子，且有阻止皮膚中的酪氨酸轉化為黑色素的作用，故膠原蛋白有純天然保濕、美白、防皺、祛斑等作用，可廣泛應用于美容、美膚、美發(fā)用品中[23]。另外由于膠原蛋白獨特的

42、宏觀物理特性，用于相紙定片、紡織、造紙等領域[7。24~25]。正由于膠原蛋白在各個領域的應用前景廣闊，因而它對膠原蛋白的提取也提出了更高的要求。膠原蛋白的提取既要做到高產率、清潔化的生態(tài)化提取，也要最大程度上保留膠原蛋白的生物學性能。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]廖艷陽.膠原蛋白的研究進展[J].長沙大學學報,2009,2

43、3(5):36～38</p><p>　　[2]Kharagpur. Fish collagen: A Potential Material For Biomedical Application [J]IEEE,2010, 34～38</p><p>　　[3]王麗珍、黃素珍.膠原蛋白的研究進展[J].肉類研究,2010,131:16～22</p><p>　　[4

44、]郭文宇、代敏、楊麗紅等.水生動物與陸生動物皮膠原特性及應用前景[J].中國皮革,2007,36(17):55～57</p><p>　　[5]郭恒斌、曾慶祝.水產膠原蛋白的功能特性及其制備與應用[J].農產食品科技,2007,1(3):46～50</p><p>　　[6]郭玉華、劉揚瑞、李鈺金.魚類膠原蛋白及膠原活性多肽的研究進展[J].中國食品添加劑,2010,3:175～179&l

45、t;/p><p>　　[7]肖高、施亦東、陳衍夏.膠原蛋白的提取及其對紡織材料的改性研究[J].絲綢,2010,2:5～9</p><p>　　[8]胡立新、程驕、占穩(wěn)等.魚下角料中膠原蛋白的提取及應用[J].化學與生物工程,2009,26(2):7～9</p><p>　　[9]金桂芬、裘俊紅.海蜇膠原蛋白優(yōu)化提取條件的研究[J].浙江化工,2008,39(7):5～

46、10</p><p>　　[10]周玉惠、頁正濤、肖立芳等.豬皮膠原蛋白的提取及其結構表征[J].湖北大學學報,2008,30(3):287～289</p><p>　　[11]王川、李燕、馬志英等.幾種酶法從豬皮中提取膠原蛋白的對比研究[J].食品科學,2007,28(1):201～205</p><p>　　[12]肖世佳、但年華、曾睿等.從動物皮中提取膠原蛋白

47、的方法[J].西部皮革,2009,31(15):17～21</p><p>　　[13]劉霞.魚鰭和魚鱗中膠原蛋白的提取[J].湖南農機,2008,3:146～147</p><p>　　[14]吳緹、陳舜勝.魚皮膠原蛋白的制備及性能研究[J].內陸水產,2008,9:34～37</p><p>　　[15]鐘朝輝、李春美、顧海峰等.草魚魚鱗酸溶性膠原蛋白的提取及基

48、本特性[J].水產科學,2007, 26(3):91～94</p><p>　　[16]陳小娥、方旭波、鐘秋琴.安康魚皮中膠原蛋白的提取工藝[J].食品工業(yè)科技,2007, 28(3):131～133</p><p>　　[17]王晨、吳暉、李曉鳳等.胃蛋白酶酶解提取雞骨膠原蛋白工藝的研究[J].現代食品科技,2008, 24(12):1300～1303</p><p&

49、gt;　　[18]Defu Li, Changdao Mu, Sumei Cai e.at. Ultrasonic irradiation in the enzymatic extraction of collagen[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2007, 16:605～609</p><p>　　[19]盧曉林.膠原蛋白在醫(yī)學中的應用研究現狀[J].口腔醫(yī)學研究,2009, 1

50、5(6):806～808</p><p>　　[20]Chi H.Lee. Anujsingla, Yugyung Lee. Biomedical application of collagen [J].Internet of Pharmaceutic,2001, 221:1～22</p><p>　　[21]王丹.膠原蛋白在食品工業(yè)中的應用[J].農產食品科技,2009, 3(2):48

51、～50.54</p><p>　　[22]李興武、章黎黎.膠原蛋白的改性研究及在食品工業(yè)中的應用[J].肉類研究,2009, 11:80～84</p><p>　　[23]曹榮安、李浩、李良玉.膠原蛋白的生理功能特性及其應用[J].肉類工業(yè),2010, 345:7～9</p><p>　　[24]蘇媛媛、劉飛宏.魚鱗中膠原蛋白的利用價值[J].企業(yè)技術開發(fā),2009

52、:154</p><p>　　[25]王志杰、彭立新.膠原蛋白的提取及其配吵紙張的物理性能[J].紙和造紙,2006, 25(5):35～36</p><p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　酶解法提取牛皮膠原蛋白的條件優(yōu)化

53、</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　0 前言12</b></p><p>　　1 材料與方法13</p><p>　　1.1實驗材料13</p><p>　　1.1.1原料來源13</p><p>　　1.

54、1.2酶制劑13</p><p>　　1.1.3 儀器與設備13</p><p>　　1.1.4 試劑13</p><p>　　1.2測定方法13</p><p>　　1.2.1 酶活的測定13</p><p>　　1.2.2 牛皮中膠原蛋白含量的測定14</p><p>　　1.3

55、工藝流程14</p><p>　　1.4操作要點14</p><p>　　1.4.1 原料預處理14</p><p>　　1.4.2酶法提取牛皮膠原蛋白15</p><p>　　1.5 試驗方法15</p><p>　　1.5.1 酶及提取介質的選擇15</p><p>　　1.5.

56、2 復合酶的復合比確定15</p><p>　　1.5.3 酶提取的單因素實驗15</p><p>　　1.5.4 酶提取的最佳工藝條件正交實驗16</p><p>　　2 結果與分析16</p><p>　　2.1牛皮中膠原蛋白含量的測定結果16</p><p>　　2.1.1羥脯氨酸標準曲線的繪制16&

57、lt;/p><p>　　2.1.2牛皮中羥脯氨酸含量的測定結果17</p><p>　　2.2酶活測定結果17</p><p>　　2.3酶及提取介質對牛皮膠原蛋白提取率的影響17</p><p>　　2.4復合酶的不同復合比對牛皮膠原蛋白提取率的影響19</p><p>　　2.5酶提取的單因素實驗結果19&l

58、t;/p><p>　　2.5.1料液比對牛皮膠原蛋白提取率的影響19</p><p>　　2.5.2酶提時間對牛皮膠原蛋白提取率的影響20</p><p>　　2.5.3 酶提溫度對牛皮膠原蛋白提取率的影響21</p><p>　　2.5.4加酶量對牛皮膠原蛋白提取率的影響22</p><p>　　2.5.5乙酸濃

59、度對牛皮膠原蛋白提取率的影響22</p><p>　　2.6酶提取的最佳工藝條件正交實驗結果23</p><p><b>　　3 結論24</b></p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻24</b></p><p>　　

60、附 錄錯誤!未定義書簽。</p><p>　　摘要：膠原蛋白具有良好的物理性能和生物學特性，因而應用于化工、食品、醫(yī)學等諸多領域。本文以牛肉制品的下腳料——牛皮為原料，以膠原蛋白提取率作為指標，比較水和0.5mol/L的乙酸溶液兩種不同的介質對牛皮膠原蛋白提取率的影響，得出采用酸酶結合法更利于牛皮膠原蛋白的提取。此外，在酶的選擇上通過比較試驗，最后選擇復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復合）作為試驗用

61、酶。在此基礎上，本實驗又通過單因素試驗和正交試驗對牛皮酶解工藝條件進行了優(yōu)化，實驗結果表明酶提取的最優(yōu)條件為：以0.5mol/L的乙酸溶液為提取介質，料液比（m/V）為1:25，酶提溫度為42℃，酶提時間為8h，加酶量為3000U/g，牛皮膠原蛋白的提取率高達90.56%。</p><p>　　關鍵詞：牛皮；酶解；膠原蛋白；復合酶</p><p>　　Abstract: Due to co

62、llage’s many favorable physical and biological characteristics, it has a wide range of applications in many areas.In this paper, fresh cowhide as raw material and the extraction rte of collagen as index, the enzymic extr

63、act method combing with acetic acid is considerer a wonderful method and greatly improves the rate, when comparing the enzymic extract method combing with water. On the choice of the enzymes, the compound enzyme that the

64、 pepsin and the papain are compounded by </p><p>　　Keywords: Cowhide; enzymatic extraction; collagen; the compound enzyme</p><p><b>　　0 前言</b></p><p>　　膠原蛋白是一種白色、不透明、無支鏈

65、的纖維蛋白質[1]。膠原蛋白是哺乳動物體內含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質。膠原蛋白在脊椎動物體內占蛋白質總量25%-30%，占腱和骨骼的細胞外蛋白質總量90%以上，其中動物皮中膠原蛋白含量達到50%以上[2]。膠原蛋白是結締組織極重要的結構蛋白質，是動物結締組織中的骨、軟骨、皮膚、腱、韌等的主要成分，對機體和臟器起著支持、保護、結合以及形成界隔等作用[3-4]。</p><p>　　膠原蛋白是細胞外基質（ECM）

66、的主要成分，分子量為300ku左右。膠原蛋白最普遍的結構特征是三螺旋結構，其由3條α-鏈多肽組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構型，3條左手螺旋鏈相互纏繞成右手螺旋結構形成膠原蛋白獨特的三重螺旋結構，使其分子結構非常穩(wěn)定[5]。結構決定性質，性質決定用途。正由于膠原蛋白獨特的結構，使得膠原蛋白具有獨特的生物學性能和重要的生理作用。膠原蛋白具有低免疫原性，生物相容性，可生物降解性等[6]，另外還具有止血，修復皮膚骨骼以及美容保健等作用[7]。

67、膠原蛋白結構的多樣性和復雜性決定其在許多領域的重要地位，因而膠原蛋白產品具有良好的應用前景。如在生物醫(yī)學上，膠原蛋白具有能夠自發(fā)將體外膠原蛋白組裝成各種緊密結構的能力，因而是作為組織工程支架、醫(yī)用敷料系統(tǒng)和藥物輸送工具的潛在材料[8-9]。同時，目前有學者還開始研究膠原蛋白的其他功能，如在去除自由基和降血壓等[10]方面的研究。</p><p>　　由于膠原蛋白的諸多優(yōu)點，因此膠原蛋白的提取一直是研究的熱點。膠原

68、蛋白的提取方法通常有酸法、堿法、酶法以及酸、酶結合法和堿、酶結合法等方法[11-12]。在幾種膠原蛋白的提取方法中，酸法提取迅速而徹底，但是一些氨基酸會被破壞，如絲氨酸和酪氨酸部分被破壞，同時提取率較低；堿法提取速度很快，但是膠原蛋白結構被破壞，產生消旋作用，同時含羥基和巰基的氨基酸全部被破壞；酶法提取提取對膠原蛋白破壞性小，能更好更完全地得到活性蛋白[13]。同時，隨著生物技術水平的提高，酶制劑的來源廣泛，活性也不斷提高，價效比也大幅

69、度降低，為其在工業(yè)化生產中的應用提供了極大空間，特別是蛋白酶制劑應用已不少見，并取得明顯成效。因此，酶法提取膠原蛋白是膠原蛋白生產的一個方向[14]。但是，一般酶法的水解率不徹底，提取率一般較低，因而目前采用酸酶結合或者堿酶結合來提取膠原蛋白。</p><p>　　同時，就目前的消費趨勢來看，我國膠原蛋白的需求量逐漸增加，特別是隨著人們對飲食和健康的不斷重視，因此市場前景較為關闊。另一方面在肉制品和制革加工過程中

70、含有富含膠原物質的副產物（皮、內臟、肉骨頭），但是其利用的附加值很低。利用這些廢棄物生成膠原蛋白，既實現資源的合理和有價值利用，又實現經濟和社會效益的雙贏。本實驗以牛肉制品的下腳料--牛皮為原料，采用酶解法提取牛皮中俄膠原蛋白，同時通過試驗條件的優(yōu)化，得到較優(yōu)的提取條件，為今后的進一步研究提供參考。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>

71、<b>　　1.1實驗材料</b></p><p><b>　　1.1.1原料來源</b></p><p>　　新鮮牛皮：寧波萊盛農業(yè)科技實業(yè)有限公司提供</p><p><b>　　1.1.2酶制劑</b></p><p>　　胃蛋白酶 生化試劑

72、 Amresco</p><p>　　木瓜蛋白酶 生化試劑 國藥試劑</p><p>　　1.1.3 儀器與設備</p><p>　　HWS26型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司</p><p>　　DHG-9140AS型電熱鼓風干燥箱

73、 寧波江南儀器廠</p><p>　　Acculab ALC210.3電子天平 Acculab公司</p><p>　　T-6新銳可見分光光度計 北京普析通用有限責任公司</p><p>　　RE52-2旋轉蒸發(fā)儀

74、 上海滬西分析儀器廠</p><p>　　PB-10pH計 德國sartorius 公司</p><p>　　其他：電冰箱，錐形瓶，試管，燒杯等。</p><p><b>　　1.1.4 試劑</b></p><p>　　L-羥脯氨酸

75、 生化級 上海潤成生物科技有限公司</p><p>　　高氯酸 分析純 國藥試劑</p><p>　　正丙醇 分析純 國藥試劑</p><p>　　高氯酸 分析純

76、 國藥試劑</p><p>　　異丙醇 分析純 國藥試劑</p><p>　　檸檬酸 分析純 國藥試劑</p><p>　　乙酸鈉 分析純 國藥試劑</p><p&

77、gt;　　氯胺T 分析純 國藥試劑</p><p>　　硫酸 分析純 國藥試劑</p><p>　　對二甲基苯甲醛 分析純 國藥試劑</p><p>　　其他為實驗室常規(guī)試劑</p><

78、p><b>　　1.2測定方法</b></p><p>　　1.2.1 酶活的測定</p><p>　　酶活力測定：按照中華人民共和國專業(yè)標準SB/T10317-1999《蛋白酶活力測定法》測定。</p><p>　　1.2.2 牛皮中膠原蛋白含量的測定</p><p>　　1.2.2.1實驗原理</p>

79、;<p>　　膠原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、羥賴氨酸等，其中羥脯氨酸是膠原蛋白的特有氨基酸，在膠原蛋白中含量固定，通常為10%左右。不同來源的生物膠原蛋白含量不同，因此換算系數也不同。例如，水生生物一般采用11.1，周愛梅等[15]在研究淡水魚膠原蛋白提取優(yōu)化工藝研究中就采用11.1作為換算系數。而郭恒斌、曾慶祝[16]在研究酶法提取魷魚皮膠原蛋白工藝條件中采用14.2作為換算系數。查閱相關的資料[17]，在

80、本實驗中決定取10.0作為牛皮中膠原蛋白的換算系數。膠原蛋白的含量按公式（1.1）計算：</p><p>　　牛皮中膠原蛋白的含量﹦羥脯氨酸含量×10.0 （公式1.1）</p><p>　　1.2.2.2羥脯氨酸標準曲線的繪制</p><p>　　按照GB/T9695.23-2008《肉

81、與肉制品 羥脯氨酸含量的測定》的方法繪制標準曲線，空白對照用蒸餾水替代，過程同前。</p><p>　　1.2.2.3樣品處理與羥脯氨酸的測定</p><p>　　準確稱取4g牛皮原料于錐形瓶中，量取30mL左右配置好的3mol/L硫酸溶液加入錐形瓶中，用表面皿蓋住，置于105℃干燥箱內水解16h。水解結束后用濾紙趁熱將水解液過濾到250mL的容量瓶中，再用蒸餾水定容至刻度。按照GB/T9

82、695.23-2008測定稀釋后的樣品溶液中羥脯氨酸的濃度，樣品中的提取出的羥脯氨酸含量計算按公式（1.2）計算：</p><p>　　W＝(F×C×V×10-3) (公式1.2)</p><p><b>　　式中：</b&g

83、t;</p><p>　　C—標準曲線上相應的羥脯氨酸濃度，μg/mL；</p><p>　　W—提取出的羥脯氨酸含量，mg/g；</p><p>　　V—稀釋后溶液的總體積，mL；</p><p>　　M—稱取樣品的質量，g；</p><p><b>　　F—稀釋倍數。</b></p>

84、;<p>　　1.2.2.4膠原蛋白提取率的測定</p><p>　　將酶解后的溶液進行離心收集上清液，測定上清液體積，并從上清液中吸取5.0mL于錐形瓶中，分別加入5.0mL3mol/L的硫酸并用表面皿蓋住，放入105℃烘箱中水解16h，將水解液轉移至100mL容量瓶定容至刻度；吸取5.0mL上述溶液定容至100mL。其余各步按GB/T9695.23-2008測定其羥脯氨酸測定法操作[18]。提取

85、率的計算公式為：</p><p>　　提取率（%）＝溶液中羥脯氨酸的濃度×體積×稀釋倍數/牛皮中羥脯氨酸的含量×100% （公式1.3）</p><p><b>　　1.3工藝流程</b></p><p>　　新鮮牛皮→原料整理→原料預處理→酶法提取牛皮膠原蛋白→膠原蛋白提取率測定</p>

86、<p><b>　　1.4操作要點</b></p><p>　　1.4.1 原料預處理</p><p>　　1.4.1.1去脂肪</p><p>　　在對原料進行酶解之前，一般需要對原料進行預處理。脫脂是預處理的一部分。提取膠原蛋白的過程中，需要盡可能的去除脂肪組織。因為在膠原蛋白中一旦有脂質的混入以后不管是進行中性還是酸性溶解都很

87、難把脂肪去除，最后得到乳濁狀的膠原蛋白，最終影響產物的純度[19]。查閱資料，通常使用的脫脂方法有有機溶劑浸泡脫脂[16]與碳酸鈉浸泡脫脂。本實驗采用6%碳酸鈉溶液浸泡脫脂20h。</p><p>　　1.4.1.2去雜蛋白 </p><p>　　在原料預處理中，除了要對原料去脂肪外，還需要對原料進行去雜蛋白。從查閱的資料[15]來看，在提取膠原蛋白過程中用得最多的除雜蛋白試劑是氯化鈉溶

88、液。本實驗以5%氯化鈉溶液為去牛皮雜蛋白溶液，按1:15混合，室溫下浸泡12小時除去鹽溶性非膠原成分，再用清水沖洗牛皮數次去除殘留氯化鈉，瀝干后搗碎備用。</p><p>　　1.4.2酶法提取牛皮膠原蛋白</p><p>　　將預處理好的碎牛皮置于某種提取介質，以一定的料液比進行混合，加入適量的酶，在適宜的溫度下酶提一定時間。酶提結束后，將酶解液離心收集上清液進行提取率的測定。</

89、p><p><b>　　1.5 試驗方法</b></p><p>　　1.5.1 酶及提取介質的選擇 </p><p>　　將預處理的牛皮原料以相同的量稱取三份，以水為介質，分別加入3000U/g的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復合），以1:25的料液比，溫度為37℃，提取8h后測定提取率。其中胃蛋白酶的pH

90、調節(jié)為2.5。</p><p>　　再以相同的量稱取預處理的牛皮原料三份，以0.5mol/L乙酸溶液為介質，分別加入加酶量為3000U/g的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復合），以1:25的料液比，溫度為37℃，提取8h后測定提取率。對這兩組實驗比較后，選擇合適的提取介質和酶。</p><p>　　1.5.2 復合酶的復合比確定</p>

91、<p>　　將預處理的牛皮原料以相同的量稱取三份，分別加入加酶量為3000U/g的復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復合）、復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:2酶活比例復合）、復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按2:1酶活比例復合），以10.5mol/L乙酸溶液為介質，料液比為1:25，溫度為37℃，提取8h后測定提取率，選擇合適的復合比。</p><p>　　1.5.3 酶提取的單因素實驗 <

92、;/p><p>　　1.5.3.1 料液比的選擇</p><p>　　根據以上確定的0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質，以及實驗所得的復合酶作為試驗用酶，將預處理的牛皮原料以相同的量稱取五份，在37℃下，加酶量為3000U/g，提取時間為8h,分別以1：15，1:20,1:25，1:30，1:35的料液比下提取牛皮中的膠原蛋白。評價不同料液比對牛皮膠原蛋白的提取率影響，選定最適的料液比。&

93、lt;/p><p>　　1.5.3.2 酶提時間的選擇</p><p>　　根據以上確定的料液比，將預處理的牛皮原料以相同的量稱取五份，以0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質，在37℃下，加酶量為3000U/g,分別以4，6，8，10，12的酶提時間下提取牛皮中的膠原蛋白。評價不同酶提時間牛皮膠原蛋白提取率的影響，選定最適的浸提時間。</p><p>　　1.5.3.

94、3 酶提溫度的選擇</p><p>　　根據以上確定的料液比和酶提時間，將預處理的牛皮原料以相同的量稱取七份，以0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質，加酶量為3000U/g，分別以4℃，15℃，27℃，32℃，37℃,42℃,47℃的酶提溫度下提取牛皮中的膠原蛋白。評價不同酶提溫度對牛皮膠原蛋白提取率的影響，選定最適的浸提溫度。</p><p>　　1.5.3.4 復合酶添加量的選擇&

95、lt;/p><p>　　根據以上確定的料液比、浸提時間和浸提溫度下，將預處理的牛皮原料以相同的量稱取五份，以0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質，分別以1000U/g、2000U/g、3000U/g、4000U/g、5000U/g的加酶量下提取牛皮中的膠原蛋白。評價不同的復合酶添加量對牛皮膠原蛋白提取率的影響，選定最適的加酶量。</p><p>　　1.5.3.5 乙酸濃度的選擇</p

96、><p>　　根據以上確定的料液比、浸提時間、浸提溫度和加酶量下，將預處理的牛皮原料以相同的量稱取五份，分別以0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L、0.9mol/L的乙酸濃度下提取牛皮中的膠原蛋白。評價不同的乙酸濃度對牛皮膠原蛋白提取率的影響，選定最適的乙酸濃度。</p><p>　　1.5.4 酶提取的最佳工藝條件正交實驗</p><p&

97、gt;　　在單因素試驗的基礎上，以膠原蛋白的提取率為指標采用正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化，其因素與水平見表1.1，按L9(34)正交表進行正交試驗。</p><p>　　表1.1正交試驗因素水平表</p><p>　　Tab1.1The factors and levels of orthogonal experiment</p><p><b>　　2 結

98、果與分析</b></p><p>　　2.1牛皮中膠原蛋白含量的測定結果</p><p>　　2.1.1羥脯氨酸標準曲線的繪制</p><p>　　按照GB/T9695.23-2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量的測定》的方法，以羥脯氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，結果見圖2.1.</p><p>　　圖2.1羥脯氨酸

99、標準曲線</p><p>　　Fig.2.1The standard curves of hydroxyproline</p><p>　　如圖2.1所示，羥脯氨酸標準樣品的回歸方程為y＝0.2014x﹢0.001，y為吸光度值，x為羥脯氨酸的濃度。羥脯氨酸濃度與光密度值幾乎呈直線相關（R2＝0.9999）。因此，由此標準回歸方程計算羥脯氨酸濃度準確可靠。</p><p

100、>　　2.1.2牛皮中羥脯氨酸含量的測定結果</p><p>　　將牛皮按1.2.2.3的方法處理后，于558nm處測定其吸光值，從標準曲線上查出其相應的濃度，按照公式（2.2）計算出牛皮中羥脯氨酸的含量，結果見表2.1。</p><p>　　從表2.1中可知，牛皮中羥脯氨酸含量的平均值為2.87%。羥脯氨酸為膠原蛋白的特異氨基酸，根據公式（1.1）計算牛皮中膠原蛋白的含量。計算可得

101、膠原蛋白的平均含量為28.7%，占牛皮總質量的1/4以上。</p><p>　　表2.1牛皮中羥脯氨酸含量的測定結果</p><p>　　Tab.2.1 The content of hydroxyproline in cattle skin</p><p><b>　　2.2酶活測定結果</b></p><p>　　根

102、據中華人民共和國專業(yè)標準SB/T10317-1999《蛋白酶活力測定法》，實驗測得所用胃蛋白酶的酶活力為3.78×103U/g，木瓜蛋白酶的酶活力為6.63×103U/mg。</p><p>　　2.3酶及提取介質對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　實驗中分別采用水和0.5mol /L乙酸溶液作為提取介質，以木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白

103、酶按1:1酶活比例復合）三種酶作為試驗酶，在加酶量為3000U/g，溫度為37℃，提取時間為8h，料液比為1:25下提取牛皮中的膠原蛋白。提取結束后，按照1.4.3的方法測定牛皮中膠原蛋白的提取率，比較酶和提取介質對牛皮膠原蛋白提取率的影響，結果見圖2.2。</p><p>　　圖2.2酶及提取介質對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.2 Effect of enzy

104、me and medium on extraction of collagen</p><p>　　不同的酶對牛皮酶解效果的影響很大。在常用的蛋白酶中，胃蛋白酶常常被用來提取動物組織中的膠原，此外也有用木瓜蛋白酶和胰酶提取膠原蛋白的報道。本實驗中選擇了胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和復合酶來提取牛皮中的膠原蛋白。從圖2.2可以看出，在以水為介質中，木瓜蛋白酶的提取率比胃蛋白酶的提取率略高。這與王川、李燕、馬志英等[20]在

105、研究不同酶對豬皮膠原蛋白提取率的影響的結果一致。同時，從圖中所示，復合酶的提取率比木瓜蛋白酶與胃蛋白酶的提取率低很多。分析原因可能為：一方面，復合酶提取時的pH值適合木瓜蛋白酶的酶解作用，但是不適合胃蛋白酶的發(fā)揮作用。根據文獻[21～22]查得，胃蛋白酶作用的最適pH值在1.5～2.5之間，木瓜蛋白酶對酶解作用最適pH為5.而復合酶提取時的pH值為中性，因而胃蛋白酶的活性受抑制。另一方面，復合酶中的木瓜蛋白酶含量比第二組的木瓜蛋白酶含量

106、低。</p><p>　　而以0.5mol /L的乙酸溶液作為介質時，胃蛋白的提取率高于木瓜蛋白酶的提取率，這與所查得文獻[14]一致?？赡茉驗?.5mol /L的乙酸溶液pH在2～3之間，接近于胃蛋白酶的最適pH，利于胃蛋白酶發(fā)揮作用；而對于木瓜蛋白酶而言，此環(huán)境略偏酸性，會使木瓜蛋白酶的作用有所抑制。此外，從圖中很明顯看出，復合酶的提取率最高，與以水介質時的情況相反?？赡茉蚴且婚_始時，胃蛋白酶活性較高，發(fā)

107、揮作用；隨著酶解過程的進行，溶液pH有所升高，使得木瓜蛋白酶活性增強，兩種酶一起作用，使得酶解效果更佳，膠原蛋白提取率得到提高。因此以下實驗選擇復合酶作為實驗的酶制劑。</p><p>　　同時，不同的提取介質對酶解效果也存在著影響。目前，在酶解法提取膠原蛋白中，一般結合酸性條件下進行酶解。根據查閱的文獻[23]，通過酸性膨脹并結合酶的作用，既可以保證膠原蛋白結構的完整性，又可以提高膠原蛋白的提取率。因此，本次實

108、驗中分別以水和0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質，比較不同的提取介質對牛皮膠原蛋白提取率的影響。由圖2.2可知，以0.5mol /L的乙酸溶液作為介質時的提取率遠遠高于以水作為介質時的提取率。因此，以下實驗中選擇0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質。</p><p>　　2.4復合酶的不同復合比對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　將預處理的牛皮原料分為三份，分別加入不同復

109、合比的復合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶分別按1:1，1:2，2:1酶活比例復合），在以0.5mol/L乙酸溶液為提取介質，加酶量為3000U/g，料液比為1:25，，溫度為37℃，提取時間為8h下進行牛皮膠原蛋白的提取，研究不同復合比對牛皮膠原蛋白提取率的影響，結果如圖2.3.</p><p>　　圖2.3復合酶的復合比對牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.3 Effec