酶解法提取牛皮膠原蛋白的條件優(yōu)化【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　酶解法提取牛皮膠原蛋白的條件優(yōu)化</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 食品質(zhì)量與

2、安全 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b><

3、;/p><p><b>　　0 前言14</b></p><p>　　1 材料與方法15</p><p>　　1.1實(shí)驗(yàn)材料15</p><p>　　1.1.1原料來源15</p><p>　　1.1.2酶制劑15</p><p>　　1.1.3 儀器與設(shè)備15&l

4、t;/p><p>　　1.1.4 試劑15</p><p>　　1.2測(cè)定方法15</p><p>　　1.2.1 酶活的測(cè)定15</p><p>　　1.2.2 牛皮中膠原蛋白含量的測(cè)定15</p><p>　　1.3工藝流程16</p><p>　　1.4操作要點(diǎn)16</p&g

5、t;<p>　　1.4.1 原料預(yù)處理16</p><p>　　1.4.2酶法提取牛皮膠原蛋白16</p><p>　　1.5 試驗(yàn)方法17</p><p>　　1.5.1 酶及提取介質(zhì)的選擇17</p><p>　　1.5.2 復(fù)合酶的復(fù)合比確定17</p><p>　　1.5.3 酶提取的單

6、因素實(shí)驗(yàn)17</p><p>　　1.5.4 酶提取的最佳工藝條件正交實(shí)驗(yàn)17</p><p>　　2 結(jié)果與分析18</p><p>　　2.1牛皮中膠原蛋白含量的測(cè)定結(jié)果18</p><p>　　2.1.1羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制18</p><p>　　2.1.2牛皮中羥脯氨酸含量的測(cè)定結(jié)果18<

7、/p><p>　　2.2酶活測(cè)定結(jié)果19</p><p>　　2.3酶及提取介質(zhì)對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響19</p><p>　　2.4復(fù)合酶的不同復(fù)合比對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響20</p><p>　　2.5酶提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果20</p><p>　　2.5.1料液比對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響20<

8、;/p><p>　　2.5.2酶提時(shí)間對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響21</p><p>　　2.5.3 酶提溫度對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響22</p><p>　　2.5.4加酶量對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響23</p><p>　　2.5.5乙酸濃度對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響23</p><p>　　2.6酶提取的最

9、佳工藝條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果24</p><p><b>　　3 結(jié)論25</b></p><p>　　致 謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)25</b></p><p>　　附 錄錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p>　　摘要：膠原蛋白具有良好的

10、物理性能和生物學(xué)特性，因而應(yīng)用于化工、食品、醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域。本文以牛肉制品的下腳料——牛皮為原料，以膠原蛋白提取率作為指標(biāo)，比較水和0.5mol/L的乙酸溶液兩種不同的介質(zhì)對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響，得出采用酸酶結(jié)合法更利于牛皮膠原蛋白的提取。此外，在酶的選擇上通過比較試驗(yàn)，最后選擇復(fù)合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復(fù)合）作為試驗(yàn)用酶。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)又通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)牛皮酶解工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酶提取

11、的最優(yōu)條件為：以0.5mol/L的乙酸溶液為提取介質(zhì)，料液比（m/V）為1:25，酶提溫度為42℃，酶提時(shí)間為8h，加酶量為3000U/g，牛皮膠原蛋白的提取率高達(dá)90.56%。</p><p>　　關(guān)鍵詞：牛皮；酶解；膠原蛋白；復(fù)合酶</p><p>　　Abstract: Due to collage’s many favorable physical and biological c

12、haracteristics, it has a wide range of applications in many areas.In this paper, fresh cowhide as raw material and the extraction rte of collagen as index, the enzymic extract method combing with acetic acid is considere

13、r a wonderful method and greatly improves the rate, when comparing the enzymic extract method combing with water. On the choice of the enzymes, the compound enzyme that the pepsin and the papain are compounded by </p&

14、gt;<p>　　Keywords: Cowhide; enzymatic extraction; collagen; the compound enzyme</p><p><b>　　0 前言</b></p><p>　　膠原蛋白是一種白色、不透明、無支鏈的纖維蛋白質(zhì)[1]。膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質(zhì)。膠原蛋白在脊椎動(dòng)物體內(nèi)

15、占蛋白質(zhì)總量25%-30%，占腱和骨骼的細(xì)胞外蛋白質(zhì)總量90%以上，其中動(dòng)物皮中膠原蛋白含量達(dá)到50%以上[2]。膠原蛋白是結(jié)締組織極重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，是動(dòng)物結(jié)締組織中的骨、軟骨、皮膚、腱、韌等的主要成分，對(duì)機(jī)體和臟器起著支持、保護(hù)、結(jié)合以及形成界隔等作用[3-4]。</p><p>　　膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要成分，分子量為300ku左右。膠原蛋白最普遍的結(jié)構(gòu)特征是三螺旋結(jié)構(gòu)，其由3條α-鏈多肽組成

16、，每一條膠原鏈都是左手螺旋構(gòu)型，3條左手螺旋鏈相互纏繞成右手螺旋結(jié)構(gòu)形成膠原蛋白獨(dú)特的三重螺旋結(jié)構(gòu)，使其分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定[5]。結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，性質(zhì)決定用途。正由于膠原蛋白獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，使得膠原蛋白具有獨(dú)特的生物學(xué)性能和重要的生理作用。膠原蛋白具有低免疫原性，生物相容性，可生物降解性等[6]，另外還具有止血，修復(fù)皮膚骨骼以及美容保健等作用[7]。膠原蛋白結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性決定其在許多領(lǐng)域的重要地位，因而膠原蛋白產(chǎn)品具有良好的應(yīng)用前景。如在

17、生物醫(yī)學(xué)上，膠原蛋白具有能夠自發(fā)將體外膠原蛋白組裝成各種緊密結(jié)構(gòu)的能力，因而是作為組織工程支架、醫(yī)用敷料系統(tǒng)和藥物輸送工具的潛在材料[8-9]。同時(shí)，目前有學(xué)者還開始研究膠原蛋白的其他功能，如在去除自由基和降血壓等[10]方面的研究。</p><p>　　由于膠原蛋白的諸多優(yōu)點(diǎn)，因此膠原蛋白的提取一直是研究的熱點(diǎn)。膠原蛋白的提取方法通常有酸法、堿法、酶法以及酸、酶結(jié)合法和堿、酶結(jié)合法等方法[11-12]。在幾種膠

18、原蛋白的提取方法中，酸法提取迅速而徹底，但是一些氨基酸會(huì)被破壞，如絲氨酸和酪氨酸部分被破壞，同時(shí)提取率較低；堿法提取速度很快，但是膠原蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，產(chǎn)生消旋作用，同時(shí)含羥基和巰基的氨基酸全部被破壞；酶法提取提取對(duì)膠原蛋白破壞性小，能更好更完全地得到活性蛋白[13]。同時(shí)，隨著生物技術(shù)水平的提高，酶制劑的來源廣泛，活性也不斷提高，價(jià)效比也大幅度降低，為其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了極大空間，特別是蛋白酶制劑應(yīng)用已不少見，并取得明顯成效。因

19、此，酶法提取膠原蛋白是膠原蛋白生產(chǎn)的一個(gè)方向[14]。但是，一般酶法的水解率不徹底，提取率一般較低，因而目前采用酸酶結(jié)合或者堿酶結(jié)合來提取膠原蛋白。</p><p>　　同時(shí)，就目前的消費(fèi)趨勢(shì)來看，我國膠原蛋白的需求量逐漸增加，特別是隨著人們對(duì)飲食和健康的不斷重視，因此市場(chǎng)前景較為關(guān)闊。另一方面在肉制品和制革加工過程中含有富含膠原物質(zhì)的副產(chǎn)物（皮、內(nèi)臟、肉骨頭），但是其利用的附加值很低。利用這些廢棄物生成膠原蛋白

20、，既實(shí)現(xiàn)資源的合理和有價(jià)值利用，又實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益的雙贏。本實(shí)驗(yàn)以牛肉制品的下腳料--牛皮為原料，采用酶解法提取牛皮中俄膠原蛋白，同時(shí)通過試驗(yàn)條件的優(yōu)化，得到較優(yōu)的提取條件，為今后的進(jìn)一步研究提供參考。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>

21、;<b>　　1.1.1原料來源</b></p><p>　　新鮮牛皮：寧波萊盛農(nóng)業(yè)科技實(shí)業(yè)有限公司提供</p><p><b>　　1.1.2酶制劑</b></p><p>　　胃蛋白酶 生化試劑 Amresco</p><p>　　木瓜蛋白酶 生化

22、試劑 國藥試劑</p><p>　　1.1.3 儀器與設(shè)備</p><p>　　HWS26型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司</p><p>　　DHG-9140AS型電熱鼓風(fēng)干燥箱 寧波江南儀器廠</p><p>　　Acculab ALC

23、210.3電子天平 Acculab公司</p><p>　　T-6新銳可見分光光度計(jì) 北京普析通用有限責(zé)任公司</p><p>　　RE52-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海滬西分析儀器廠</p><p>　　PB-10pH計(jì)

24、 德國sartorius 公司</p><p>　　其他：電冰箱，錐形瓶，試管，燒杯等。</p><p><b>　　1.1.4 試劑</b></p><p>　　L-羥脯氨酸 生化級(jí) 上海潤成生物科技有限公司</p>

25、<p>　　高氯酸 分析純 國藥試劑</p><p>　　正丙醇 分析純 國藥試劑</p><p>　　高氯酸 分析純 國藥試劑</p><p>　　異丙醇

26、 分析純 國藥試劑</p><p>　　檸檬酸 分析純 國藥試劑</p><p>　　乙酸鈉 分析純 國藥試劑</p><p>　　氯胺T 分析純 國藥試劑&l

27、t;/p><p>　　硫酸 分析純 國藥試劑</p><p>　　對(duì)二甲基苯甲醛 分析純 國藥試劑</p><p>　　其他為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑</p><p><b>　　1.2測(cè)定方法</b></p><

28、;p>　　1.2.1 酶活的測(cè)定</p><p>　　酶活力測(cè)定：按照中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T10317-1999《蛋白酶活力測(cè)定法》測(cè)定。</p><p>　　1.2.2 牛皮中膠原蛋白含量的測(cè)定</p><p>　　1.2.2.1實(shí)驗(yàn)原理</p><p>　　膠原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、羥賴氨酸等，其中羥脯氨酸

29、是膠原蛋白的特有氨基酸，在膠原蛋白中含量固定，通常為10%左右。不同來源的生物膠原蛋白含量不同，因此換算系數(shù)也不同。例如，水生生物一般采用11.1，周愛梅等[15]在研究淡水魚膠原蛋白提取優(yōu)化工藝研究中就采用11.1作為換算系數(shù)。而郭恒斌、曾慶祝[16]在研究酶法提取魷魚皮膠原蛋白工藝條件中采用14.2作為換算系數(shù)。查閱相關(guān)的資料[17]，在本實(shí)驗(yàn)中決定取10.0作為牛皮中膠原蛋白的換算系數(shù)。膠原蛋白的含量按公式（1.1）計(jì)算：<

30、/p><p>　　牛皮中膠原蛋白的含量﹦羥脯氨酸含量×10.0 （公式1.1）</p><p>　　1.2.2.2羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制</p><p>　　按照GB/T9695.23-2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量的測(cè)定》的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，空白對(duì)照用蒸餾水替代，過程同前。</p&

31、gt;<p>　　1.2.2.3樣品處理與羥脯氨酸的測(cè)定</p><p>　　準(zhǔn)確稱取4g牛皮原料于錐形瓶中，量取30mL左右配置好的3mol/L硫酸溶液加入錐形瓶中，用表面皿蓋住，置于105℃干燥箱內(nèi)水解16h。水解結(jié)束后用濾紙趁熱將水解液過濾到250mL的容量瓶中，再用蒸餾水定容至刻度。按照GB/T9695.23-2008測(cè)定稀釋后的樣品溶液中羥脯氨酸的濃度，樣品中的提取出的羥脯氨酸含量計(jì)算按公

32、式（1.2）計(jì)算：</p><p>　　W＝(F×C×V×10-3) (公式1.2)</p><p><b>　　式中：</b></p><p>　　C—標(biāo)準(zhǔn)曲線上相應(yīng)的羥脯氨酸濃度，μg/mL；

33、</p><p>　　W—提取出的羥脯氨酸含量，mg/g；</p><p>　　V—稀釋后溶液的總體積，mL；</p><p>　　M—稱取樣品的質(zhì)量，g；</p><p><b>　　F—稀釋倍數(shù)。</b></p><p>　　1.2.2.4膠原蛋白提取率的測(cè)定</p><p

34、>　　將酶解后的溶液進(jìn)行離心收集上清液，測(cè)定上清液體積，并從上清液中吸取5.0mL于錐形瓶中，分別加入5.0mL3mol/L的硫酸并用表面皿蓋住，放入105℃烘箱中水解16h，將水解液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶定容至刻度；吸取5.0mL上述溶液定容至100mL。其余各步按GB/T9695.23-2008測(cè)定其羥脯氨酸測(cè)定法操作[18]。提取率的計(jì)算公式為：</p><p>　　提取率（%）＝溶液中羥脯氨酸的濃度

35、×體積×稀釋倍數(shù)/牛皮中羥脯氨酸的含量×100% （公式1.3）</p><p><b>　　1.3工藝流程</b></p><p>　　新鮮牛皮→原料整理→原料預(yù)處理→酶法提取牛皮膠原蛋白→膠原蛋白提取率測(cè)定</p><p><b>　　1.4操作要點(diǎn)</b></p>

36、<p>　　1.4.1 原料預(yù)處理</p><p>　　1.4.1.1去脂肪</p><p>　　在對(duì)原料進(jìn)行酶解之前，一般需要對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理。脫脂是預(yù)處理的一部分。提取膠原蛋白的過程中，需要盡可能的去除脂肪組織。因?yàn)樵谀z原蛋白中一旦有脂質(zhì)的混入以后不管是進(jìn)行中性還是酸性溶解都很難把脂肪去除，最后得到乳濁狀的膠原蛋白，最終影響產(chǎn)物的純度[19]。查閱資料，通常使用的脫脂方法

37、有有機(jī)溶劑浸泡脫脂[16]與碳酸鈉浸泡脫脂。本實(shí)驗(yàn)采用6%碳酸鈉溶液浸泡脫脂20h。</p><p>　　1.4.1.2去雜蛋白 </p><p>　　在原料預(yù)處理中，除了要對(duì)原料去脂肪外，還需要對(duì)原料進(jìn)行去雜蛋白。從查閱的資料[15]來看，在提取膠原蛋白過程中用得最多的除雜蛋白試劑是氯化鈉溶液。本實(shí)驗(yàn)以5%氯化鈉溶液為去牛皮雜蛋白溶液，按1:15混合，室溫下浸泡12小時(shí)除去鹽溶性非膠原

38、成分，再用清水沖洗牛皮數(shù)次去除殘留氯化鈉，瀝干后搗碎備用。</p><p>　　1.4.2酶法提取牛皮膠原蛋白</p><p>　　將預(yù)處理好的碎牛皮置于某種提取介質(zhì)，以一定的料液比進(jìn)行混合，加入適量的酶，在適宜的溫度下酶提一定時(shí)間。酶提結(jié)束后，將酶解液離心收集上清液進(jìn)行提取率的測(cè)定。</p><p><b>　　1.5 試驗(yàn)方法</b><

39、;/p><p>　　1.5.1 酶及提取介質(zhì)的選擇 </p><p>　　將預(yù)處理的牛皮原料以相同的量稱取三份，以水為介質(zhì)，分別加入3000U/g的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及復(fù)合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復(fù)合），以1:25的料液比，溫度為37℃，提取8h后測(cè)定提取率。其中胃蛋白酶的pH調(diào)節(jié)為2.5。</p><p>　　再以相同的量稱取預(yù)處理的牛皮原料三份

40、，以0.5mol/L乙酸溶液為介質(zhì)，分別加入加酶量為3000U/g的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及復(fù)合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復(fù)合），以1:25的料液比，溫度為37℃，提取8h后測(cè)定提取率。對(duì)這兩組實(shí)驗(yàn)比較后，選擇合適的提取介質(zhì)和酶。</p><p>　　1.5.2 復(fù)合酶的復(fù)合比確定</p><p>　　將預(yù)處理的牛皮原料以相同的量稱取三份，分別加入加酶量為3000U/g的復(fù)合

41、酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復(fù)合）、復(fù)合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:2酶活比例復(fù)合）、復(fù)合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按2:1酶活比例復(fù)合），以10.5mol/L乙酸溶液為介質(zhì)，料液比為1:25，溫度為37℃，提取8h后測(cè)定提取率，選擇合適的復(fù)合比。</p><p>　　1.5.3 酶提取的單因素實(shí)驗(yàn) </p><p>　　1.5.3.1 料液比的選擇</p>&l

42、t;p>　　根據(jù)以上確定的0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)，以及實(shí)驗(yàn)所得的復(fù)合酶作為試驗(yàn)用酶，將預(yù)處理的牛皮原料以相同的量稱取五份，在37℃下，加酶量為3000U/g，提取時(shí)間為8h,分別以1：15，1:20,1:25，1:30，1:35的料液比下提取牛皮中的膠原蛋白。評(píng)價(jià)不同料液比對(duì)牛皮膠原蛋白的提取率影響，選定最適的料液比。</p><p>　　1.5.3.2 酶提時(shí)間的選擇</p>

43、<p>　　根據(jù)以上確定的料液比，將預(yù)處理的牛皮原料以相同的量稱取五份，以0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)，在37℃下，加酶量為3000U/g,分別以4，6，8，10，12的酶提時(shí)間下提取牛皮中的膠原蛋白。評(píng)價(jià)不同酶提時(shí)間牛皮膠原蛋白提取率的影響，選定最適的浸提時(shí)間。</p><p>　　1.5.3.3 酶提溫度的選擇</p><p>　　根據(jù)以上確定的料液比和酶提時(shí)間

44、，將預(yù)處理的牛皮原料以相同的量稱取七份，以0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)，加酶量為3000U/g，分別以4℃，15℃，27℃，32℃，37℃,42℃,47℃的酶提溫度下提取牛皮中的膠原蛋白。評(píng)價(jià)不同酶提溫度對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響，選定最適的浸提溫度。</p><p>　　1.5.3.4 復(fù)合酶添加量的選擇</p><p>　　根據(jù)以上確定的料液比、浸提時(shí)間和浸提溫度下，將預(yù)處理

45、的牛皮原料以相同的量稱取五份，以0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)，分別以1000U/g、2000U/g、3000U/g、4000U/g、5000U/g的加酶量下提取牛皮中的膠原蛋白。評(píng)價(jià)不同的復(fù)合酶添加量對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響，選定最適的加酶量。</p><p>　　1.5.3.5 乙酸濃度的選擇</p><p>　　根據(jù)以上確定的料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度和加酶量下，將預(yù)處理的

46、牛皮原料以相同的量稱取五份，分別以0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L、0.9mol/L的乙酸濃度下提取牛皮中的膠原蛋白。評(píng)價(jià)不同的乙酸濃度對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響，選定最適的乙酸濃度。</p><p>　　1.5.4 酶提取的最佳工藝條件正交實(shí)驗(yàn)</p><p>　　在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以膠原蛋白的提取率為指標(biāo)采用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，其因素與

47、水平見表1.1，按L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。</p><p>　　表1.1正交試驗(yàn)因素水平表</p><p>　　Tab1.1The factors and levels of orthogonal experiment</p><p><b>　　2 結(jié)果與分析</b></p><p>　　2.1牛皮中膠原蛋白含

48、量的測(cè)定結(jié)果</p><p>　　2.1.1羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制</p><p>　　按照GB/T9695.23-2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量的測(cè)定》的方法，以羥脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2.1.</p><p>　　圖2.1羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Fig.2.1The standard c

49、urves of hydroxyproline</p><p>　　如圖2.1所示，羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的回歸方程為y＝0.2014x﹢0.001，y為吸光度值，x為羥脯氨酸的濃度。羥脯氨酸濃度與光密度值幾乎呈直線相關(guān)（R2＝0.9999）。因此，由此標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算羥脯氨酸濃度準(zhǔn)確可靠。</p><p>　　2.1.2牛皮中羥脯氨酸含量的測(cè)定結(jié)果</p><p>　　

50、將牛皮按1.2.2.3的方法處理后，于558nm處測(cè)定其吸光值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相應(yīng)的濃度，按照公式（2.2）計(jì)算出牛皮中羥脯氨酸的含量，結(jié)果見表2.1。</p><p>　　從表2.1中可知，牛皮中羥脯氨酸含量的平均值為2.87%。羥脯氨酸為膠原蛋白的特異氨基酸，根據(jù)公式（1.1）計(jì)算牛皮中膠原蛋白的含量。計(jì)算可得膠原蛋白的平均含量為28.7%，占牛皮總質(zhì)量的1/4以上。</p><p&g

51、t;　　表2.1牛皮中羥脯氨酸含量的測(cè)定結(jié)果</p><p>　　Tab.2.1 The content of hydroxyproline in cattle skin</p><p><b>　　2.2酶活測(cè)定結(jié)果</b></p><p>　　根據(jù)中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T10317-1999《蛋白酶活力測(cè)定法》，實(shí)驗(yàn)測(cè)得所用胃蛋白酶的

52、酶活力為3.78×103U/g，木瓜蛋白酶的酶活力為6.63×103U/mg。</p><p>　　2.3酶及提取介質(zhì)對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　實(shí)驗(yàn)中分別采用水和0.5mol /L乙酸溶液作為提取介質(zhì)，以木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及復(fù)合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復(fù)合）三種酶作為試驗(yàn)酶，在加酶量為3000U/g，溫度為37℃，提取時(shí)間為8h

53、，料液比為1:25下提取牛皮中的膠原蛋白。提取結(jié)束后，按照1.4.3的方法測(cè)定牛皮中膠原蛋白的提取率，比較酶和提取介質(zhì)對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖2.2。</p><p>　　圖2.2酶及提取介質(zhì)對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.2 Effect of enzyme and medium on extraction of collagen</p>

54、;<p>　　不同的酶對(duì)牛皮酶解效果的影響很大。在常用的蛋白酶中，胃蛋白酶常常被用來提取動(dòng)物組織中的膠原，此外也有用木瓜蛋白酶和胰酶提取膠原蛋白的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中選擇了胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合酶來提取牛皮中的膠原蛋白。從圖2.2可以看出，在以水為介質(zhì)中，木瓜蛋白酶的提取率比胃蛋白酶的提取率略高。這與王川、李燕、馬志英等[20]在研究不同酶對(duì)豬皮膠原蛋白提取率的影響的結(jié)果一致。同時(shí)，從圖中所示，復(fù)合酶的提取率比木瓜蛋白酶與胃

55、蛋白酶的提取率低很多。分析原因可能為：一方面，復(fù)合酶提取時(shí)的pH值適合木瓜蛋白酶的酶解作用，但是不適合胃蛋白酶的發(fā)揮作用。根據(jù)文獻(xiàn)[21～22]查得，胃蛋白酶作用的最適pH值在1.5～2.5之間，木瓜蛋白酶對(duì)酶解作用最適pH為5.而復(fù)合酶提取時(shí)的pH值為中性，因而胃蛋白酶的活性受抑制。另一方面，復(fù)合酶中的木瓜蛋白酶含量比第二組的木瓜蛋白酶含量低。</p><p>　　而以0.5mol /L的乙酸溶液作為介質(zhì)時(shí)，胃

56、蛋白的提取率高于木瓜蛋白酶的提取率，這與所查得文獻(xiàn)[14]一致?？赡茉?yàn)?.5mol /L的乙酸溶液pH在2～3之間，接近于胃蛋白酶的最適pH，利于胃蛋白酶發(fā)揮作用；而對(duì)于木瓜蛋白酶而言，此環(huán)境略偏酸性，會(huì)使木瓜蛋白酶的作用有所抑制。此外，從圖中很明顯看出，復(fù)合酶的提取率最高，與以水介質(zhì)時(shí)的情況相反?？赡茉蚴且婚_始時(shí)，胃蛋白酶活性較高，發(fā)揮作用；隨著酶解過程的進(jìn)行，溶液pH有所升高，使得木瓜蛋白酶活性增強(qiáng)，兩種酶一起作用，使得酶解效

57、果更佳，膠原蛋白提取率得到提高。因此以下實(shí)驗(yàn)選擇復(fù)合酶作為實(shí)驗(yàn)的酶制劑。</p><p>　　同時(shí)，不同的提取介質(zhì)對(duì)酶解效果也存在著影響。目前，在酶解法提取膠原蛋白中，一般結(jié)合酸性條件下進(jìn)行酶解。根據(jù)查閱的文獻(xiàn)[23]，通過酸性膨脹并結(jié)合酶的作用，既可以保證膠原蛋白結(jié)構(gòu)的完整性，又可以提高膠原蛋白的提取率。因此，本次實(shí)驗(yàn)中分別以水和0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)，比較不同的提取介質(zhì)對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影

58、響。由圖2.2可知，以0.5mol /L的乙酸溶液作為介質(zhì)時(shí)的提取率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以水作為介質(zhì)時(shí)的提取率。因此，以下實(shí)驗(yàn)中選擇0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)。</p><p>　　2.4復(fù)合酶的不同復(fù)合比對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　將預(yù)處理的牛皮原料分為三份，分別加入不同復(fù)合比的復(fù)合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶分別按1:1，1:2，2:1酶活比例復(fù)合），在以0.5mol/

59、L乙酸溶液為提取介質(zhì)，加酶量為3000U/g，料液比為1:25，，溫度為37℃，提取時(shí)間為8h下進(jìn)行牛皮膠原蛋白的提取，研究不同復(fù)合比對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖2.3.</p><p>　　圖2.3復(fù)合酶的復(fù)合比對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.3 Effect of different compound proportion on extraction

60、 of collagen</p><p>　　從圖2.3中，可以看出，木瓜蛋白酶與胃蛋白酶酶活比為1:1復(fù)合時(shí)提取率最高，因此確定復(fù)合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復(fù)合，以下統(tǒng)稱為復(fù)合酶）作為酶制劑來提取牛皮中的膠原蛋白。</p><p>　　2.5酶提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　2.5.1料液比對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p>

61、<p>　　以0.5mol/L的乙酸溶液為介質(zhì)，加酶量為3000U/g，浸提時(shí)間為8h，溫度為37℃下，考察不同料液比對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖2.4。</p><p>　　圖2.4料液比對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.4 Effect of different solid-liquid ratio on extraction of col

62、lagen</p><p>　　由圖2.4可知，料液比（m/V）在1：15～1:35范圍內(nèi)，隨著提取介質(zhì)的增加，提取率不斷增加，當(dāng)料液比在1:25時(shí)達(dá)到最大值；但當(dāng)提取介質(zhì)繼續(xù)增加時(shí)，提取率開始緩慢降低。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是隨之提取介質(zhì)的增加，底物濃度隨之降低。當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，提取一段時(shí)間后溶液中膠原蛋白達(dá)到較大值，但是溶液較粘稠，必然會(huì)影響膠原蛋白的溶解；當(dāng)?shù)孜餄舛冉档偷揭欢ǔ潭群?，溶液較稀，對(duì)膠原的繼續(xù)溶

63、解影響較小；同時(shí)酶與底物的接觸機(jī)率降低，酶與底物的作用減少使得提取率降低[24]。因此，從提高提取率、減少醋酸溶液用量和降低后續(xù)操作負(fù)荷的角度考慮，料液比控制在1:25左右?？傮w上看，料液比對(duì)提取率的提高不是很明顯。</p><p>　　2.5.2酶提時(shí)間對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　以0.5mol/L的乙酸溶液為介質(zhì)，加酶量為3000U/g，溫度為37℃，料液比為1:2

64、5（m/V），研究不同酶提時(shí)間對(duì)牛皮中膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖2.5。</p><p>　　由圖2.5可知，在前8h內(nèi)隨酶提時(shí)間延長，膠原蛋白提取率增加較快，超過8h提取率增加緩慢。分析原因：當(dāng)提取時(shí)間較少時(shí)，牛皮中的膠原蛋白還沒有完全溶解到溶液中，因此隨著時(shí)間的增加膠原蛋白的提取率也會(huì)增加；膠原蛋白的提取率達(dá)到某一極限值后，再增加提取時(shí)間，膠原的提取率也不會(huì)有明顯的增加[20]。因此，為縮短提取工藝周期，

65、提高生產(chǎn)效率，提取時(shí)間應(yīng)控制在8h以內(nèi)。</p><p>　　圖2.5 酶提時(shí)間對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.5 Effect of different immersion time on extraction of collagen</p><p>　　2.5.3 酶提溫度對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p&

66、gt;　　確定酶提時(shí)間為8h，以0.5mol/L乙酸溶液為介質(zhì)，加酶量為3000U/g，料液比為1：25（m/V），研究不同酶提溫度對(duì)牛皮中膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖2.6。</p><p>　　圖2.6 酶提溫度對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.6 Effect of different immersion temperature on extraction

67、 of collagen</p><p>　　由圖2.6可知，當(dāng)溫度在30℃以下時(shí)，隨著溫度的增加提取率相應(yīng)增加，但是增加速率較慢；當(dāng)溫度在30～40℃左右，隨著溫度的增加，提取率增加較快；到超過40℃后，增加速率比較緩慢。分析原因：根據(jù)查得文獻(xiàn)得，胃蛋白酶的最適溫度在37℃，木瓜蛋白酶的最適溫度在60℃。當(dāng)溫度低于30℃時(shí)，兩種酶的活性受到抑制，無法正常發(fā)揮作用；當(dāng)溫度在30～40℃左右，達(dá)到胃蛋白酶的最適溫度

68、，同時(shí)靠近木瓜蛋白酶的最適溫度，因此提取速率增加加快；當(dāng)溫度超過45℃后，可能部分胃蛋白酶失活，同時(shí)膠原蛋白也可能發(fā)生變性，因此增加速率較緩慢。從提高提取率兼顧節(jié)省成本角度考慮，可選用42℃作為提取溫度。</p><p>　　2.5.4加酶量對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　以42℃作為酶提溫度，以0.5mol/L乙酸溶液為介質(zhì)，確定酶提時(shí)間為8h，料液比為1：25（m/V）

69、，研究不同加酶量對(duì)牛皮中膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖2.7。</p><p>　　從圖2.7所示，隨著加酶量的增加，膠原蛋白的提取率增加速率較快；當(dāng)達(dá)到3000U/g時(shí)，達(dá)到最大值；但當(dāng)加酶量繼續(xù)增加時(shí)，增加很緩慢，幾乎在同一條直線上。分析原因：當(dāng)加酶量較小時(shí)，底物濃度相對(duì)較大，足以使酶飽和，在此種情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比，因此，當(dāng)酶用量增加時(shí)，酶解反應(yīng)的速度隨之增加，提取率增加較快；當(dāng)酶用量增加到一定程

70、度后，底物濃度不足以使酶飽和，在增加酶用量也不會(huì)使反應(yīng)速度明顯增加,這與查得的文獻(xiàn)[25]類似。故從節(jié)約成本的角度考慮，復(fù)合酶的加酶量選擇在3000U/g。</p><p>　　圖2.7 加酶量對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.7 Effect of different enzyme concentration on extraction of collagen&

71、lt;/p><p>　　2.5.5乙酸濃度對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　在加酶量為3000U/g，酶提溫度為42℃，酶提時(shí)間為8h，料液比為1：25（m/V）下，研究不同乙酸濃度對(duì)牛皮中膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖2.8。</p><p>　　從圖2.8所示，不同的乙酸濃度會(huì)影響牛皮中膠原蛋白的提取率。乙酸濃度在0.5～0.7mol/L時(shí)，提取率較高

72、，低于0.5mol/L或者高于0.7mol/L時(shí)，提取率有所降低。分析原因：當(dāng)乙酸濃度低于0.5mol/L時(shí)，pH值有所提高，適合木瓜蛋白酶的作用，但是不適合胃蛋白酶發(fā)揮作用，提取率有所限制；當(dāng)高于0.7mol/L，酸性較強(qiáng)，木瓜蛋白酶活性受抑制，提取率無法提高；總體上而言，乙酸濃度對(duì)牛皮中膠原蛋白提取率的影響不是很明顯。在本實(shí)驗(yàn)中，從乙酸用量的角度和提取率的角度，選擇0.5mol/L的乙酸溶液作為提取介質(zhì)。</p>&l

73、t;p>　　圖2.8 乙酸濃度對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響</p><p>　　Fig.2.8 Effect of acetic acid concentration on extraction of collagen</p><p>　　2.6酶提取的最佳工藝條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，按L9(34

74、)正交表進(jìn)行正交，結(jié)果見表2.2。</p><p>　　表2.2正交試驗(yàn)的結(jié)果與分析</p><p>　　Tab.2.2 The results analysis of orthogonal experiment</p><p>　　從表2.2可以看出，三個(gè)因素對(duì)膠原蛋白提取率的影響依次為C＞＞A＞B,優(yōu)化所得條件為：A3B2C3，即酶提溫度為47℃，酶提時(shí)間為8h

75、，加酶量為4000U/g。但從極差分析的三個(gè)平均值（k值）來看，溫度的后兩個(gè)水平相差不大，同時(shí)從經(jīng)濟(jì)與實(shí)際應(yīng)用的角度考慮，酶提溫度應(yīng)選42℃，酶提時(shí)間為8h,加酶量為4000U/g.通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得在此條件下酶提牛皮中膠原蛋白的提取率為90.56%。</p><p><b>　　3 結(jié)論</b></p><p>　　3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛皮中羥脯氨酸的含量為2.

76、87%，膠原蛋白的含量為28.7%，占牛皮總重量的1/4以上。</p><p>　　3.2 實(shí)驗(yàn)中比較水和0.5mol/L的乙酸溶液兩種不同的介質(zhì)對(duì)牛皮膠原蛋白提取率的影響，得出采用酸酶結(jié)合法更利于牛皮膠原蛋白的提取。</p><p>　　3.3 在酶的選擇上，實(shí)驗(yàn)中分別比較胃蛋白酶、木瓜蛋白酶這兩種單酶與復(fù)合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復(fù)合）的膠原蛋白提取效果，得出復(fù)合酶更

77、利于牛皮膠原蛋白的提取。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中探索了復(fù)合酶不同的復(fù)合比對(duì)膠原蛋白提取率的影響，最后選擇復(fù)合酶（木瓜蛋白酶與胃蛋白酶按1:1酶活比例復(fù)合）作為試驗(yàn)用酶。</p><p>　　3.4 在單因素和正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上并結(jié)合實(shí)際綜合考慮，得到最佳的酶解工藝條件為：以0.5mol/L的乙酸溶液為提取介質(zhì)，料液比（m/V）為1:25，酶提溫度為42℃，酶提時(shí)間為8h，加酶量為3000U/g，膠原蛋白的提取率為90.56%。

78、</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 李二鳳, 何小維, 羅志剛.膠原蛋白的提取工藝研究[J] . 食品研究與開發(fā), 2006, (27) : 64-67.</p><p>　　[2] 付強(qiáng). 膠原高得率提取法及膠原膜性能的研究[C] . 四川大學(xué)碩士學(xué)位論文. 四川 : 四川大學(xué), 2006 : 2-5.

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