高產(chǎn)靈菌紅素培養(yǎng)條件優(yōu)化[畢業(yè)設(shè)計+開題報告+文獻綜述]_第1頁
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文檔簡介

1、<p>  本科畢業(yè)設(shè)計(論文)</p><p><b> ?。ǘ?屆)</b></p><p>  高產(chǎn)靈菌紅素培養(yǎng)條件優(yōu)化</p><p>  所在學(xué)院 </p><p>  專業(yè)班級 生物工程 </p&

2、gt;<p>  學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>  指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>  完成日期 年 月 </p><p>  摘要: 靈菌紅素(prodigiosins,PG)是一些放線菌、沙雷氏菌及其它細菌產(chǎn)生

3、的具有重要生物活性的次級代謝產(chǎn)物。本實驗通過單因子實驗,對沙雷氏菌發(fā)酵工藝進行研究,找到一個優(yōu)于現(xiàn)有配方的培養(yǎng)基配比,實驗結(jié)果得出利用2%的花生為培養(yǎng)基,較甘油蛋白胨培養(yǎng)基,降低了91.1%的生產(chǎn)成本。</p><p>  關(guān)鍵詞: 靈菌紅素; 沙雷氏菌; 發(fā)酵工藝優(yōu)化</p><p>  Abstract:Prodigiosins with important biological

4、activity secondary metabolites are produced by a number of Actinomycetes, Serratia and other bacteria. Through the investigation of single-factor experiment design, Conditions of fermentation of Prodigiosins were inves

5、tigated, The results of the use of 2% of peanuts litter than Glycerine-Protein Culture, reducing 91.1% of the culture of the cost of production.</p><p>  Keywords: prodigious;Serratia; fermentation conditio

6、ns</p><p><b>  目 錄</b></p><p>  摘要…………………………………………………………………………………………………… Ⅰ </p><p>  Abstract………………………………………………………………………………………………… Ⅱ</p><p>  1 緒論……………

7、………………………………………………………………………………… (1)</p><p>  1.1 靈菌紅素的基本性質(zhì)……………………………………………………………………… (1)</p><p>  1.2 選題的背景及意義…………………………………………………………………………(1)</p><p>  1.3 靈菌紅素的研究動態(tài)…………………………………

8、……………………………………(1)</p><p>  1.3.1 最新應(yīng)用研究動態(tài)………………………………………………………………… (1)</p><p>  1.3.2 生產(chǎn)現(xiàn)狀…………………………………………………………………………… (2)</p><p>  1.4 實驗的目的、內(nèi)容和難點………………………………………………………………… (3)&

9、lt;/p><p>  2 方法與材料……………………………………………………………………………………… (4)</p><p>  2.1 實驗材料…………………………………………………………………………………… (4)</p><p>  2.1.1 菌種…………………………………………………………………………………………(4)</p><

10、p>  2.1.2 主要儀器與試劑……………………………………………………………………………(4)</p><p>  2.1.3 培養(yǎng)基………………………………………………………………………………………(4)</p><p>  2.2 實驗方法…………………………………………………………………………………………(4)</p><p>  2.2.1

11、 種子的培養(yǎng)與優(yōu)化…………………………………………………………………………(4)</p><p>  2.2.2 種子的擴大培養(yǎng)……………………………………………………………………………(4)</p><p>  2.2.3 紅色素的提取………………………………………………………………………………(5) 2.2.4 靈菌紅素含量測定………………………………………………………………

12、…………(5)</p><p>  2.2.5 單因素實驗…………………………………………………………………………………(5)</p><p>  3 結(jié)果與分析…………………………………………………………………………………………(8)</p><p>  3.1 單因素實驗 …………………………………………………………………………………(8)</p>

13、;<p>  3.2 生產(chǎn)成本計算……………………………………………………………………………… (13)</p><p>  4 結(jié)論 ………………………………………………………………………………………………(14) </p><p>  參考文獻………………………………………………………………………………………… (15) 致謝…………………………………………………………

14、…………………………………… (17)</p><p><b>  1 緒論</b></p><p>  1.1 靈菌紅素的基本性質(zhì)</p><p>  靈菌紅素(prodigiosins,PG)是一類天然紅色素的總稱, 1929年由Amark等研究Serratia生長時發(fā)現(xiàn),包括prodigioSin,prodigio Sin 25-C,me

15、tacyc1oprodigiosin (MP)desmethoxyprodigiosi和uncedy1prodigiosin(UP)等,通常都有3個吡咯環(huán)組成的甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)[1-2]。靈菌紅素屬于脂溶性色素,易溶于甲醇和丙酮,不溶于水,在極性較強的酸性和堿性水溶液中微溶,在極性較弱的有機溶劑如乙醚或石油醚中微溶或不溶;靈菌紅素對溫度穩(wěn)定,一般在90度以下都很穩(wěn)定,但受pH的影響較大,酸性環(huán)境中能保持較長的時間,堿性條件下則損失較大

16、;A1,Ca,K ,Ba 等金屬離子對靈菌紅素的穩(wěn)定性影響不大,Zn 有使靈菌紅素增色的作用,Mg 和Mn 對靈菌紅素有一定的破壞作用,Pb 可以絡(luò)合靈菌紅素,使之成為沉淀;白光和藍光使靈菌紅素發(fā)生光解,在紅光和遠紅光下靈菌紅素則不會降解[3]。</p><p>  1.2 選題的背景及意義</p><p>  隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的提高,合成色素對人體健康的危害越來越引人注目。

17、大量的研究報告指出,基本所有的合成色素都不能向人體提供營養(yǎng)物質(zhì),一些色素還會危害人體健康。其中的危害包括一般毒性、致瀉性、致突性(基因突變)和致癌性。因此合成色素作為食品添加劑的用量越來越少,甚至被眾多國家禁止使用。而天然色素具有安全、無毒、色澤亮麗誘人,尤一些天然色素本身就是人們?nèi)粘o嬍车某煞郑幸欢ǖ臓I養(yǎng)價值和藥理保健作用,因此倍受人們的矚目[4]。</p><p>  現(xiàn)今,天然色素(PG)的種類并不多,靈

18、菌紅素就是天然色素之一。靈菌紅素有一定的免疫活性,如抑制真菌、細菌和霉菌等功效,且具有抗腫瘤作用,因此具有很大的藥用價值。除此之外,靈菌紅素在紡織染色方面也比其他染料有優(yōu)勢,受到科研工作者和企業(yè)家的極大關(guān)注,具有創(chuàng)造巨大經(jīng)濟價值的潛力。</p><p>  目前,主要是通過微生物發(fā)酵來獲得靈菌紅素,能產(chǎn)生靈菌紅素的微生物主要有鏈霉菌屬(Streptomyces)、沙雷氏菌屬(Serratia)和假單胞菌(pseu

19、domonas)等種屬[5-6]。其中又以沙雷氏菌屬生產(chǎn)靈菌紅素最受關(guān)注,報道也最多。但是,利用微生物發(fā)酵的靈菌紅素還存在很多問題,例如產(chǎn)靈菌紅素的菌種不穩(wěn)定,產(chǎn)量較低和成本偏高等。</p><p>  1.3 靈菌紅素的研究動態(tài)</p><p>  1.3.1 最新應(yīng)用研究動態(tài)</p><p>  近年來靈菌紅素的在醫(yī)學(xué)、環(huán)境治理,紡織染色以及食品上的應(yīng)用越來越廣

20、泛,具有很高的利用價值。</p><p>  根據(jù)靈菌紅素的抗腫瘤、免疫抑制活性、抗菌、抗瘧疾活性等作用,在醫(yī)學(xué)上有巨大的發(fā)展?jié)摿?。在抗腫瘤方面,靈菌紅素對比起另外一些化學(xué)療法藥劑,如環(huán)磷琉胺(cyclophosphamide)具有低細胞毒作用,只有當(dāng)濃度大于300nM時才具有明顯的淋巴細胞抑制作用。而后者在其有效濃度時毒性已非常高[7]。</p><p>  第一、靈菌紅素能引發(fā)Cu2+

21、誘導(dǎo)的雙鏈DNA的裂解與其分子中A環(huán)的結(jié)構(gòu)密切相關(guān),完整的雙吡咯環(huán)發(fā)色團結(jié)構(gòu)是靈菌紅素顯現(xiàn)銅介導(dǎo)的核酸酶活性的關(guān)鍵之一[8]。</p><p>  第二、靈菌紅素可以破化細胞內(nèi)的線粒體,高爾基體和溶酶體對細胞質(zhì)的pH梯度,降低細胞內(nèi)ATP水平[9-10]。這是由于靈菌紅素可以在這些細胞器的膜上起到離子孔(Ionophore)的作用,而抵消H+的同向轉(zhuǎn)運。</p><p>  第三、靈菌紅素

22、可以激活細胞內(nèi)細胞凋亡途徑。一方面,靈菌紅素激活前半胱天冬酶8(Pro-Caspase 8),繼而啟動了細胞內(nèi)半胱天冬酶依賴的細胞凋亡。另一方面,它也可以使線粒體釋放其細胞凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis inducing factor,簡稱AIF)而觸發(fā)非半胱天冬酶依賴的細胞凋亡。除此之外,靈菌紅素還會通過一系列誘導(dǎo)或抑制的作用達到抑制細胞周期的目的。另外,根據(jù)Zhang等研究中,靈菌紅素還可以促進細胞集結(jié),阻止癌細胞對周遭組織的入侵

23、或是遠端轉(zhuǎn)移[11-12]。</p><p>  在環(huán)境治理方面,據(jù)韓國科學(xué)家對海洋微生物的研究中,發(fā)現(xiàn)靈菌紅素對消除赤潮有良好的作用[13]。這一發(fā)現(xiàn),能有效治理水體由富營養(yǎng)化引起的赤潮,并且是使用生物天然的治理方法,具有高度的安全性,對環(huán)境的修復(fù)和保持有重大的意義。</p><p>  在紡織染色方面,靈菌紅素染色效果比其他合成色素有優(yōu)勢。鐘綿國等對靈菌紅素染色的研究,發(fā)現(xiàn)靈菌紅素比其

24、他染色材料更容易染色,并且染色色度更鮮艷,并且不易洗脫。還有根據(jù)靈菌紅素的抗菌性,對被染色的材料還有一定的抑菌性。這在紡織上有很大的發(fā)展空間[14]。</p><p>  在食品方面,色素是一種食品添加劑,這直接影響人們的健康。天然色素作為食品添加劑具有較高的安全性,無毒、色澤亮麗誘人,尤其是一些天然色素本身就是人們?nèi)粘o嬍车某煞郑幸欢ǖ臓I養(yǎng)價值和藥理保健作用,備受各界的關(guān)注。</p><p

25、>  1.3.2 生產(chǎn)現(xiàn)狀</p><p>  20世紀(jì)60年代早期,Rapoport等首先描述了靈菌紅素化學(xué)合成的全過程,但是比較復(fù)雜和困難。1996年D’Alessio [15]等提出了新的制備PG類似物的方案,先將C環(huán)和B環(huán)相連然后再和A環(huán)結(jié)合即得PG前體物質(zhì),步驟簡單,合成效率明顯提高,但不能成功合成天然的十二烷基PG。</p><p>  利用化學(xué)合成法不能合成純天然的PG

26、,因此,人們寄希望于微生物發(fā)酵生產(chǎn),并且,研究多為使用沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素。</p><p>  王學(xué)東[7]對野生黏質(zhì)沙雷菌株進行紫外誘變處理,篩選獲得的鏈霉素抗性菌株搖瓶產(chǎn)量達到120 mg/L,發(fā)酵產(chǎn)量可達160 mg/L。</p><p>  Tao 等[16]利用紫外誘變獲得了一株沙雷菌株 B6,以葡萄糖為初始碳源,流加甘油為靈菌紅素合成誘導(dǎo)物,所開發(fā)的流加發(fā)酵工藝不僅可防止

27、菌體過早自溶,而且可部分消除靈菌紅素產(chǎn)物的抑制作用,將靈菌紅素的產(chǎn)量提高了7.8倍,達583mg/L。</p><p>  Wei等[17-18]以改進LB培養(yǎng)基,提高胰蛋白胨和酵母膏的濃度并去除了NaCl發(fā)酵沙雷氏菌生產(chǎn)靈菌紅素,約比LB增產(chǎn)了3倍,達152mg/L;在培養(yǎng)基中添加 2%-6% 的植物油,如豆油、棕櫚油、葵花子油等可促進靈菌紅素的合成,最高達790 mg/L,表明靈菌紅素合成與胞外生物表面活性劑

28、的存在有關(guān)。Cang 等從土壤中分離獲得一株沙雷菌 S389,以乙醇為唯一碳源,靈菌紅素產(chǎn)量最高可達2.95g/L。</p><p>  Giri等[19]在黏質(zhì)沙雷菌的培養(yǎng)基中分別添加花生籽粉、芝麻粉、咖啡粉,不添加其他物質(zhì),均能顯著增加靈菌紅素產(chǎn)量,其中以添加花生籽粉最為顯著,達到38.75g/L。</p><p>  Helvia等[20]在沙雷氏菌的培養(yǎng)基中分別添加木薯廢水和甘露醇

29、,能顯著增加靈菌紅素的產(chǎn)量,并大大的降低了生產(chǎn)的成本,并且靈菌紅素的產(chǎn)量達到49.5 g/L。</p><p>  1.4 實驗的目的、內(nèi)容與難點</p><p>  本課題所研究探討的是通過改變沙雷氏菌的培養(yǎng)條件,主要是碳源、氮源的替換來降低靈菌紅素的生產(chǎn)成本。其中使用的碳源、氮源均為廉價的農(nóng)業(yè)農(nóng)作物和工業(yè)廢棄物,在發(fā)酵靈菌紅素的過程中產(chǎn)量不穩(wěn)定,數(shù)據(jù)的變動較大。其次,靈菌紅素是一種脂溶

30、性的物質(zhì),易溶于發(fā)酵液中,不易完全提取。因此,如何找到合適的碳源、氮源,如何穩(wěn)定靈菌紅素的生產(chǎn),有效的提取靈菌紅素的本試驗的難點,加大了實驗的工作強度。</p><p><b>  2 實驗部分</b></p><p><b>  2.1 實驗材料</b></p><p><b>  2.1.1 菌種<

31、;/b></p><p>  黏質(zhì)沙雷氏菌( Serratia jx.1),本實驗室保藏。</p><p>  2.1.2 主要儀器與試劑</p><p>  HD-930組合式全溫度震蕩培養(yǎng)箱 (大倉市博萊特實驗儀器廠);</p><p>  VS-15000CFN II 型小型高速離心機(上海民儀電子有限公司);</p>

32、;<p>  VS-1300型潔凈工作臺(蘇州時速為凈化設(shè)備有限公司);</p><p>  PHS-3C型精密pH計(上海安亨昌吉149號雷磁儀器廠);</p><p>  AL-204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);</p><p>  752s 紫外可見分光光度計 (上海棱光技術(shù)有限公司);</p><p>

33、  DSX-280A型不銹鋼手提式滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);</p><p>  LRH-250A型生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)。</p><p>  本實驗所用丙酮、氯化鈉、硫酸鎂、甘油、乙酸乙酯等均為分析純;PN5247蛋白胨、牛肉浸膏等均為生化試劑。</p><p>  2.1.3 培養(yǎng)基</p><p>  種子培養(yǎng)基 (g/

34、L):牛肉膏3.0,蛋白胨10.0,NaCl 5.0,瓊脂15,pH 7.4-7.6。</p><p>  擴大培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 13.0,甘油20.0 Nacl 5.0 搖瓶裝液量 20mL/250mL(V/V)pH自然。</p><p>  發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨13.0, 甘油20.0, MgSO4 1.2, NaCl 5.0, Gly 2.0,搖瓶裝液量50 mL/2

35、50mL(V/V),接種量5%(V/V),pH 5.7。</p><p><b>  2.2 實驗方法</b></p><p>  2.2.1 種子的培養(yǎng)和優(yōu)化</p><p>  種子培養(yǎng)基的配制:按照種子培養(yǎng)基的組成稱取牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,瓊脂15g,放到1000mL的燒杯中加水至1000mL,加熱攪拌

36、溶解,用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH,使其在7.4-7.6。然后分裝在250mL的搖瓶中,用滅菌鍋在121℃下滅菌20min,最后再倒平板。待平板冷卻后在無菌條件下,用接種針挑取甘油管中的菌種劃平板,放在生化培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)12h,即得到活化的沙雷氏菌,將其放于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>  2.2.2 種子的擴大培養(yǎng)</p><p>  分別稱

37、?。╣/L)蛋白胨13.0、甘油20.0、NaCl 5.0加入燒杯中加水,攪拌,使燒杯中的物料都溶解并分裝于250mL的搖瓶中,每個搖瓶裝50mL的培養(yǎng)基,并用滅菌鍋在121℃下高溫蒸汽滅菌20min,待搖瓶內(nèi)的培養(yǎng)基冷卻后在無菌條件下接種,用接種針挑取平板上的單菌落于搖瓶中。接種完后,液體培養(yǎng)12h,培養(yǎng)溫度為28℃,轉(zhuǎn)速為170r/min。</p><p>  2.2.3 靈菌紅素的發(fā)酵培養(yǎng)</p&g

38、t;<p>  把擴大培養(yǎng)基中的種子接種于不同的發(fā)酵培養(yǎng)基,接種量為2%。接種完后,液體培養(yǎng)55h,培養(yǎng)溫度為28℃,轉(zhuǎn)速為170r/min。</p><p>  2.2.3 紅色素與菌體的提取</p><p>  轉(zhuǎn)接后放在搖床里培養(yǎng)55h后取出,搖勻,分別用移液槍移取1.00mL發(fā)酵液于1.5mL離心管中,4℃,12000r/min,離心10min。棄上清液,然后用移液

39、槍移取1mL的丙酮于各個離心管中,用100μL槍頭攪拌使色素完全溶于丙酮中,再離心,溫度為4℃,10000r/min,離心10min。得到靈菌紅素丙酮溶液。若上清液的顏色比較深,取0.5mL的上清液放入10mL的試管中,加入1mL的乙酸乙酯,加入食鹽,形成過飽和溶液,用鹽酸將其調(diào)至酸性,然后震蕩,將靈菌紅素萃取到乙酸乙酯相中。</p><p>  2.2.4 靈菌紅素含量測定</p><p&

40、gt;  本實驗利用靈菌紅素在535nm波長下具有最大吸收峰的特性,將提取的靈菌紅素丙酮溶液或乙酸乙酯溶液稀釋10-100倍后于535nm波長下測量吸光度并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出發(fā)酵液中靈菌紅素含量。</p><p>  2.2.5 單因子實驗</p><p>  實驗選取不同的碳源、氮源進行單因子實驗,其中碳源分別為棉籽柏、菜柏、花生柏、玉米粉、玉米淀粉、小麥粉、山芋淀粉、玉米皮、花生油

41、、芝麻油、麩皮等,用其替代對照培養(yǎng)基中的甘油;氮源為小黃豆粉、黃豆粉、豆柏、豆奶粉、花生粉、豆蛋白粉等,用其代替對照培養(yǎng)基中的氮源,除此之外還有碳源氮源一起替換的為花生粉,芝麻粉,工業(yè)廢水等,進行對照培養(yǎng),選出對靈菌紅素生產(chǎn)影響較大的幾種因素,再把被選取的因素各制成不同濃度梯度的實驗用培養(yǎng)基。接種后置于28℃,170rpm搖床中培養(yǎng)55h,提取后測量吸光度并換算成濃度,比較各因子的顯著性,實驗平行三次。</p><p

42、>  碳源、氮源的原料初篩分別見表2-1,表2-2;單因素濃度設(shè)定見表2-3。</p><p>  表2-1 碳源粗篩原料列表</p><p>  表2-2 氮源初篩原料列表</p><p>  表2-3單因素濃度梯度列表</p><p><b>  3 結(jié)果與分析</b></p><p>

43、;  紅色素作為一類具有重要生物活性的微生物次級代謝產(chǎn)物,在醫(yī)藥、紡織、食品等領(lǐng)域均具有巨大的應(yīng)用潛力,但現(xiàn)報道的紅色素的產(chǎn)量很低,影響了它進一步的研究開發(fā),本實驗分別考察了不同的培養(yǎng)條件對紅色素的胞外積累量和對菌株生長的影響,以便確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)條件,獲得最高的紅色素的積累量,加快紅色素的工業(yè)化進程。</p><p><b>  3.1 單因素實驗</b></p><

44、p>  3.1.1 替代碳源初選實驗</p><p>  圖1 不同氮源對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>  其中編號分別為:1—-棉籽粕;2—-菜粕;3—-花生粕;4—-玉米粕;5—-玉米淀粉;6—-小麥粉;7—-山芋淀粉;8—-玉米皮;9—-花生油;10—-芝麻油;11—-麩皮。</p><p>  實驗結(jié)果表明:花生油和芝麻油替代甘油作為碳源的所獲得

45、的靈菌紅素最多,其次是花生粕、小麥粉、山芋淀粉、玉米粕、玉米淀粉,而棉籽粕、菜粕、玉米皮、麩皮基本不生產(chǎn)靈菌紅素。因此,選取小麥粉、山芋淀粉、玉米粉、花生粕做濃度梯度實驗。</p><p>  3.1.2 碳源濃度梯度實驗</p><p>  圖2 小麥粉對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>  圖3 山芋淀粉對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p

46、>  圖4玉米粉對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>  圖5 花生粕對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>  根據(jù)以上實驗,處理數(shù)據(jù)得到:小麥粉的濃度為15g/L時所得的靈菌紅素吸光度最大,產(chǎn)量最高。其次是花生粕,山芋淀粉,玉米粉。其中花生粕的產(chǎn)量沒有呈一個大體的趨勢,分析原因,可能是:原料中花生粕的含量不均勻;發(fā)酵生產(chǎn)過程中靈菌紅素的在搖瓶上附著多,沒有完全融到發(fā)酵液中,使取樣困

47、難。</p><p>  3.1.3 替代氮源初選實驗</p><p>  圖6 不同氮源替代對靈菌紅素的影響</p><p>  其中編號分別為:1—-小黃豆粉;2—-黃豆粉;3—-豆粕;4—-豆奶粉;5—-豆蛋白粉。</p><p>  實驗結(jié)果表明:小黃豆粉替代蛋白胨生產(chǎn)靈菌紅素產(chǎn)量最高,其次是豆粕,黃豆粉 豆奶粉,豆蛋白粉。因此選取小

48、黃豆粉做濃度梯度實驗。</p><p>  3.1.4 氮源濃度梯度實驗</p><p>  根據(jù)以上實驗結(jié)果和文獻的參考,選取了6種因素做濃度梯度實驗,結(jié)果如下:</p><p>  圖7 小黃豆粉對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>  圖8 純花生對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>  圖9 純芝麻粉對靈菌紅素

49、產(chǎn)量的影響</p><p>  圖10 純小麥粉對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>  圖11 純小黃豆粉對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>  圖12 工業(yè)廢水對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>  實驗結(jié)果表明:20g/L純花生培養(yǎng)生產(chǎn)靈菌紅素所得的吸光度最大,說明相對的靈菌紅素的產(chǎn)量最大,其次是20g/L純芝麻粉、60g/L純小麥

50、粉、10g/L純小黃豆粉、10g/L小黃豆粉、50(mL/50mL)工業(yè)廢水。</p><p>  為了方便對各因素進行橫向和縱向的比較,我們使用甘油蛋白胨培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基,進行比較,根據(jù)以上實驗結(jié)果得出,使用2%純花生粉發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素,所得的靈菌紅素丙酮溶液和乙酸乙酯溶液的所測得的吸光度值最大。分別提取等體積的純花生發(fā)酵液和甘油蛋白胨發(fā)酵液中的靈菌紅素,稱量其干重均能達到5g/L。</p>&

51、lt;p>  3.2 生產(chǎn)成本計算</p><p>  甘油蛋白胨發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨13.0, 甘油20.0, MgSO4 1.2, NaCl 5.0, Gly 2.0。其每種原料的價格和配1L培養(yǎng)基的成本列表(表3-2-1)如下:</p><p><b>  表3-2-1</b></p><p>  純花生培養(yǎng)基(g/L):花

52、生米20。其價格和配1L培養(yǎng)基的成本列表(表3-2-2)如下:</p><p><b>  表3-2-2</b></p><p>  現(xiàn)在花生粒的價格一般為7.5元/500g,因此配置1L的純花生培養(yǎng)基所需要的成本為0.3元。</p><p>  實驗室使用甘油蛋白胨培養(yǎng)基和純花生培養(yǎng)基生產(chǎn)靈菌紅素的產(chǎn)量基本上相同均為5 g/L,因此,使用甘油

53、蛋白胨配方生產(chǎn)靈菌紅素的生產(chǎn)成本為670元/Kg,純花生配方的為60元/Kg。靈菌紅素的成本降低了約91.1%,節(jié)約了生產(chǎn)成本,更利于工業(yè)化生產(chǎn)。</p><p><b>  4 結(jié)論</b></p><p>  本研究課題主要是對產(chǎn)靈菌紅素的沙雷氏菌的培養(yǎng)條件的優(yōu)化,降低生產(chǎn)成本。實驗首先選取了多種比價廉價及普遍的原料來替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源,進行碳、氮源的

54、初篩實驗;其次,根據(jù)碳氮、源的初篩實驗,選取了小麥粉、山芋淀粉、玉米粉、花生粕和小黃豆粉5種原料做梯度實驗,實驗結(jié)果表明10 g/L濃度下的小黃豆粉培養(yǎng)基生產(chǎn)靈菌紅素最多。通過參考文獻,選取了純花生、純芝麻、純小麥粉、純小黃豆粉、工業(yè)廢水5種原料做梯度實驗,實驗結(jié)果表明使用20 g/L濃度下的純花生培養(yǎng)基生產(chǎn)靈菌紅素產(chǎn)量最大,其次是純芝麻粉。綜合實驗結(jié)果,篩選出一種相對靈菌紅素生產(chǎn)影響最大的配方,其配方為:2%花生粉,搖瓶裝液量50 m

55、L/250mL(V/V),接種量2%(V/V),培養(yǎng)溫度28℃,搖床轉(zhuǎn)速170r/min,培養(yǎng)55h。發(fā)酵生產(chǎn)的靈菌紅素產(chǎn)量稱干重約為5g/L,與實驗室原來的最佳培養(yǎng)所發(fā)酵生產(chǎn)的色素差不多,但是卻大大的降低了91.1%的原料生產(chǎn)成本。</p><p><b>  參考文獻</b></p><p>  [1] Shieh W Y, Chen Y W, Chaw S M,

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72、t;<b>  文獻綜述</b></p><p>  高產(chǎn)靈菌紅素菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化</p><p>  摘要:靈菌紅素是(prodigiosins,PG)一類研究較多的天然紅色素,含甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)。是一些放線菌、沙雷氏菌及其他細菌的次級代謝產(chǎn)物,具有免疫抑制、抗細菌、抗真菌和抗瘧疾等多種生物活性。由于靈菌紅素的各種生理活性,因而成為研究的熱點?,F(xiàn)對靈菌紅素的結(jié)構(gòu)、

73、生物活性、生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢作一綜述。</p><p>  關(guān)鍵字:靈菌紅素 抗腫瘤 抑菌</p><p><b>  前言</b></p><p>  在人類生活中所使用的色素,一般分為合成色素和天然色素兩大類 。隨著各種分析技術(shù)和病理學(xué)的發(fā)展,合成色素的安全性得到了質(zhì)疑?,F(xiàn)今,人們抵制使用合成色素的情緒日益激烈,合成色素在各國所

74、允許的使用限度大大降低,尤其在食品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)[1]。因此,開發(fā)天然色素是世界應(yīng)用色素發(fā)展的趨勢,天然色素具有安全可靠性,營養(yǎng),沒有毒副作用,色調(diào)自然,純天然等優(yōu)點,同時還有一定的藥理作用。隨著行業(yè)的發(fā)展,色素的應(yīng)用也隨之不斷擴大,對天然色素的需求不斷的提高。而靈菌紅素就是最熱的天然色素之一。</p><p>  靈菌紅素是一類天然色素的總稱,它是一類混合物,通常都有3個吡咯環(huán)組成的甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu),這個

75、結(jié)構(gòu)是由Amak等研究Serrati生長時發(fā)現(xiàn)的,包括prodigiosin,prodigiosim25-C,metacycloprodigiosi(nMP)desmethoxyprodigiosin和uncedylprodigiosin(UP)等,是由一些放線菌、沙雷氏菌及其他細菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[2-3],具有多種生物活性,如抗腫瘤活性,免疫抑制、抗細菌、抗真菌和抗瘧疾等。</p><p>  目前,靈菌紅

76、素主要是通過微生物發(fā)酵法獲得,能產(chǎn)生靈菌紅素的微生物主要有鏈霉菌屬(Streptomyces)、沙雷氏菌屬(Serratia)和假單胞菌(pseudomonas)等種屬[4],而其中以沙雷氏菌屬(Serratia)微生物合成靈菌紅素的報道最多。</p><p>  1、靈菌紅素的物理、化學(xué)性質(zhì)</p><p>  PG 屬于脂溶性色素,易溶于甲醇和丙酮,不溶于水,在極性較強的酸性和堿性水溶

77、液中微溶,在極性較弱的有機溶劑如乙醚或石油醚中微溶或不溶;PG 對溫度穩(wěn)定,但受pH 的影響較大,酸性環(huán)境中能保持較長的時間,堿性條件下則損失較大;Al3+,Ca2+,K+ ,Ba2+ 等金屬離子對PG 的穩(wěn)定性影響不大,Zn2+ 有使PG 增色的作用,Mg2+ 和Mn2+ 對PG有一定的破壞作用,Pb2+ 可以絡(luò)合PG,使之成為沉淀[5];白光和藍光使PG 發(fā)生光解,在紅光和遠紅光下PG 則不會降解[6]。</p>&l

78、t;p>  2、靈菌紅素的生物活性</p><p><b>  2.1抗腫瘤活性 </b></p><p>  Montaner等[7]的研究表明,靈菌紅素能誘導(dǎo)人結(jié)腸腺癌細胞株DLD-1 和SW-620 及人胃癌細胞株HGT-1凋亡,對轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞株 SW-620 更為有效,其誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡呈劑量依賴性,主要表現(xiàn)為細胞收縮、染色質(zhì)縮合、肌動蛋白微絲結(jié)構(gòu)重

79、組等。目前對PG 的抗腫瘤作用機制尚不十分清楚,對PG 誘導(dǎo)細胞凋亡機制的研究主要集中于與細胞存活相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),Montaner 等認為,PG 色素通過誘導(dǎo)p38-MAP 激酶(p38-MAPK)的磷酸化而促使細胞凋亡。</p><p>  Songia[8] 等則認為,靈菌紅素通過抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤易感基因(retinblastoma,Rb)的磷酸化作用與抑制細胞周期蛋白酶2和4(Cdk-2,Cdk-4)阻滯

80、人淋巴細胞的增殖。</p><p>  Yamamoto等[9]將靈菌紅素的抗腫瘤作用歸因于能促使H+和Cl-的同向跨膜轉(zhuǎn)移,引起空泡型H+-ATP酶(V-ATPase)解離,使胞液酸化引起凋亡。Castillo-Avila等研究了靈菌紅素對結(jié)腸癌細胞溶酶體內(nèi)pH值及細胞繁殖周期的影響,結(jié)果表明,靈菌紅素 促使溶酶體內(nèi)pH 升高,結(jié)腸癌細胞株 HT29 的繁殖被阻滯在 G1期,支持了Yamamoto 等胞液酸化從

81、而引起凋亡的觀點。但此觀點備受爭論,其焦點是胞液酸化在細胞凋亡中能起到多大作用。</p><p>  Melvin 等[10]認為,靈菌紅素對腫瘤細胞的殺滅作用與其核酸酶特性相關(guān)。由于靈菌紅素富含電子而被氧化并還原 Cu 2+,引發(fā)銅離子誘導(dǎo)的雙鏈DNA 裂解,表現(xiàn)出細胞毒活性。并用顯微熒光技術(shù)研究了靈菌紅素對DNA的結(jié)合作用,用瓊脂糖凝膠電泳研究了靈菌紅素對銅離子誘導(dǎo)的DNA裂解的作用。</p>

82、<p>  Subramanian 等[11]從微球菌(Micrococcus sp.)分離出靈菌紅素結(jié)構(gòu)類似物具有核酸酶特性及抗腫瘤活性,實驗表明,此化合物能有效地與 DNA 結(jié)合,并促進銅離子介導(dǎo)的 DNA裂解及膜脂質(zhì)過氧化,對鼠源淋巴瘤細胞株EL4和人源慢性骨髓瘤細胞株 K562 有顯著的細胞毒活性,抑制瘤細胞的增殖。</p><p>  Zhang 等[12]研究了靈菌紅素對胰腺惡性腫瘤細胞株8

83、898 的抑制作用,研究表明,靈菌紅素在較低的濃度下即可對8898胰腺癌細胞的增殖產(chǎn)生明顯抑制,而且,與非腫瘤細胞的Swiss-3T3細胞的平行實驗表明靈菌紅素對腫瘤細胞具有一定的特異性抗細胞增殖的作用,而非腫瘤細胞對于靈菌紅素的作用敏感性較低。</p><p>  以上研究表明,靈菌紅素具有抗腫瘤性性能,能在醫(yī)學(xué)上有巨大的應(yīng)用潛力。</p><p><b>  2.2 抑菌活性

84、</b></p><p>  靈菌紅素具有抗細菌、抗真菌的生物活性。Cang等[13]以沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)的PG做抗菌實驗,結(jié)果表明,對芽孢桿菌具有顯著地殺滅租用。其結(jié)構(gòu)類似物具有顯著的抗 Tri-chophyton spp.等真菌的活性,在臨床測試中表現(xiàn)出對Coccidmycosis引起的一種地方性真菌傳染病有良好的治愈作用[14]。</p><p>  2.3 免疫抑制性活性

85、</p><p>  選擇性免疫抑制包括在自體免疫性疾病治療和臨床器官移植中能抑制信號傳遞,預(yù)防T 細胞激活。研究表明,PG 色素抑制磷酸化并激活細胞質(zhì)酪氨酸激酶JAK-3,與細胞表面受體common γ-chain結(jié)合,阻斷common γ-chain 的信號轉(zhuǎn)換功能從而表現(xiàn)出特效的免疫抑制活性[15]。因而,PG是一種潛在的新型免疫抑制藥物。PG能顯著抑制由多克隆絲裂原PHA和PWM刺激的人源T淋巴細胞及B淋

86、巴細胞的增殖,還能促使Con A(伴刀豆球蛋白)刺激的脾細胞凋亡,但對脂多糖刺激的脾細胞增殖無抑制作用(只有濃度較高時對脂多糖刺激的鼠源B淋巴細胞有抑制作用)。表明此化合物能選擇性地抑制T淋巴細胞增殖,同時可誘導(dǎo)人源T淋巴細胞株Jurkat cells發(fā)生凋亡,以及抑制氫離子遷移。因此,PG 是一種潛在的新型免疫抑制藥物。</p><p><b>  2.4 抗瘧疾活性</b></p&

87、gt;<p>  Isaka等[16]從Streptomyces spectabilis BCC 4785的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的MP 有顯著的抗瘧疾活性。體外實驗表明,其抑制Plasmodium falciparum K1的IC50為0.005 0±0.001 0μg/mL。</p><p>  此外,靈菌紅素能保護海洋細菌免遭太陽輻射損害或原生動物侵蝕,具有抗Dinoflagellate

88、s的活性[17],靈菌紅素對引起查格斯疾病的錐蟲(一種寄生蟲)有很大的殺傷作用,其殺錐蟲活性(IC50=5μmol)是經(jīng)典殺錐蟲藥 Nifurtimox 活性(IC50=150μmol)的 30倍。靈菌紅素可作為生物農(nóng)藥用于防治Botrytis cinerea等引起的櫻草屬植物病害。對其抗菌、抗瘧疾和抗原生動物等的作用機制有待進一步研究。</p><p>  靈菌紅素具有強烈的細胞溶解酶活性,能殺滅引起赤潮的浮游

89、藻類[18],將其撒在赤潮中,1/10的濃度1h就能殺滅導(dǎo)致赤潮的大部分浮游生物。</p><p>  3、靈菌紅素的生產(chǎn)現(xiàn)狀</p><p>  20世紀(jì)60年代早期,Rapoport等首先描述了PG化學(xué)合成的全過程,但是比較復(fù)雜和困難。1996年D’Alessio [19]等提出了新的制備PG類似物的方案,先將C環(huán)和B環(huán)相連然后再和A環(huán)結(jié)合(以往模擬生物合成路線是先將B環(huán)和A環(huán)相連)即

90、得PG前體物質(zhì),步驟簡單,合成效率明顯提高,但不能用來合成天然的十二烷基PG。</p><p>  利用化學(xué)合成法不能合成純天然的PG,因此,人們寄希望于微生物發(fā)酵生產(chǎn)。并且,研究多為使用沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素。</p><p>  王學(xué)東[20]對野生黏質(zhì)沙雷菌株進行紫外誘變處理,篩選獲得的鏈霉素抗性菌株搖瓶產(chǎn)量達到120 mg/L,發(fā)酵產(chǎn)量可達160 mg/L。</p>

91、<p>  Tao 等[21]紫外誘變獲得了一株沙雷菌株 B6,以葡萄糖為初始碳源,流加甘油為 靈菌紅素合成誘導(dǎo)物,所開發(fā)的流加發(fā)酵工藝不僅可防止菌體過早自溶,而且可部分消除 靈菌紅素 產(chǎn)物的抑制作用,將 靈菌紅素 的合成能力提高了7.8倍,達583mg/L。</p><p>  Wei等[22-23]以改進LB培養(yǎng)基,提高胰蛋白胨和酵母膏的濃度并去除了NaCl發(fā)酵沙雷氏菌生產(chǎn)靈菌紅素,約比LB增產(chǎn)了

92、3倍,達152mg/L;在培養(yǎng)基中添加 2%-6% 的植物油,如豆油、棕櫚油、葵花子油等可促進靈菌紅素的合成,最高達790 mg/L,表明靈菌紅素合成與胞外生物表面活性劑的存在有關(guān)。在YE培養(yǎng)基中添加含吡咯環(huán)的脯氨酸、組氨酸和天冬氨酸可顯著促進 UP 的合成。當(dāng)添加 10g/L 的脯氨酸時,產(chǎn)量可達 2.5g/L。Cang 等從土壤中分離獲得一株沙雷菌 S389,以乙醇為唯一碳源,靈菌紅素 產(chǎn)量最高可達2.95g/L。</p>

93、;<p>  Giri等[24]在黏質(zhì)沙雷菌的培養(yǎng)基中分別添加花生籽粉、芝麻粉、咖啡粉,均能顯著增加靈菌紅素產(chǎn)量,其中以添加花生籽粉最為顯著,達到38.75g/L。</p><p>  Helvia等[25]在沙雷氏菌的培養(yǎng)基中分別添加木薯廢水和甘露醇,能顯著增加靈菌紅素的產(chǎn)量,并大大的降低了生產(chǎn)的成本,并且靈菌紅素的產(chǎn)量達到49.5 g/L。</p><p>  4、靈菌紅

94、素的應(yīng)用前景</p><p>  4.1 在食品上的應(yīng)用</p><p>  色素可以作為一種食品添加劑,人類最初使用的都是天然色素,但是隨著合成色素發(fā)明之后,逐漸取代了天然色素。但是,隨著人們生活水平的提高,人們對飲食安全越來越注重,發(fā)現(xiàn)合成色素使用過量有致癌的危險,對人體有巨大的危害。而天然色素作為食品添加劑,具有安全性,無毒,色澤鮮艷,還具有一定的營養(yǎng)和藥理保健作用,有完全取代合成色

95、素的潛力。</p><p>  4.2 在紡織染色上的應(yīng)用</p><p>  研究表明,使用靈菌紅素來染色,其結(jié)果比其他染料的顏色更易上色,更鮮艷,耐洗等優(yōu)點,還有,靈菌紅素本身具有抑菌性等性能,對被染色的紡織物有殺菌的作用,對人體更安全。而且,靈菌紅素在紡織染色上使用的純度要求并不高,對色素的分離提取要求較低。但是,靈菌紅素對光具有光敏性,在光下,易分解[26]。總之,靈菌紅素在紡織上

96、的應(yīng)用前景較大。</p><p>  4.3 在環(huán)境發(fā)明想應(yīng)用</p><p>  1996年韓國科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn),靈菌紅素可以很好的治理赤潮。將靈菌紅素撒在赤潮中,只需十億分之一的濃度,一小時后就能將導(dǎo)致赤潮的浮游生物大部分殺死。這一發(fā)現(xiàn),在環(huán)境特別是水體赤潮污染有巨大的意義[27]。</p><p>  4.4 在醫(yī)學(xué)臨床上的應(yīng)用</p><p

97、>  根據(jù)靈菌紅素的生物活性,抗腫瘤性,免疫抑制性,抑菌性等,在醫(yī)學(xué)上有著巨大的前景。但是靈菌紅素在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用,需要很高的純度,必須通過國家藥用標(biāo)準(zhǔn),這對靈菌紅素的下游的分離提取有嚴(yán)格的要求。雖然靈菌紅素的醫(yī)學(xué)作用機理還不是很清楚,但大體上分為三個方面來作用細胞:</p><p>  第一、靈菌紅素能引發(fā)銅離子誘導(dǎo)的雙鏈DNA的裂解與其分子中A環(huán)的結(jié)構(gòu)密切相關(guān),完整的雙吡咯環(huán)發(fā)色團結(jié)構(gòu)靈菌紅素顯現(xiàn)銅介導(dǎo)的

98、核酸酶活性的關(guān)鍵。</p><p>  第二、靈菌紅素可以破化細胞內(nèi)的線粒體,高爾基體和溶酶體對細胞質(zhì)的pH梯度,降低細胞內(nèi)ATP水平。這是由于靈菌紅素可以在這些細胞器的膜上起到離子孔(Ionophore)的作用,而抵消氫氯離子的同向轉(zhuǎn)運。</p><p>  第三、靈菌紅素可以激活細胞內(nèi)細胞凋亡途徑。一方面,靈菌紅素激活前半胱天冬酶8(Pro-Caspase 8),繼而啟動了細胞內(nèi)半胱天

99、冬酶依賴的細胞凋亡。另一方面,它也可以使線粒體釋放其細胞凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis inducing factor,簡稱AIF)而觸發(fā)非半胱天冬酶依賴的細胞凋亡。除此之外,靈菌紅素還會通過一系列誘導(dǎo)或抑制的作用達到抑制細胞周期的目的。另外,根據(jù)Zhang等研究中,靈菌紅素還可以促進細胞集結(jié),阻止癌細胞對周遭組織的入侵或是遠端轉(zhuǎn)移。</p><p><b>  總結(jié)</b></p&

100、gt;<p>  綜合上述,靈菌紅素在抗腫瘤,抗菌等方面有高的療效,并在多個領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用的空間,在未來會帶來高的經(jīng)濟價值。但是,現(xiàn)在廣泛的應(yīng)用靈菌紅素還存在很多的問題。首先,發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素的菌株不穩(wěn)定,在進行多次傳代之后要進行復(fù)壯,否則其生產(chǎn)能力會大大的降低。其次,在進行菌株誘變時,其正向誘變的機會比較小,有較強的隨機性,重復(fù)性差。第三,現(xiàn)在培養(yǎng)靈菌紅素所使用的原料,均屬于高價值的原料,生產(chǎn)成本高。第四,靈菌紅素是一種

101、水溶性差的物質(zhì),易溶于有機溶劑,不溶于水,但是,在發(fā)酵過程中,由于菌的代謝和原料本身的屬性,靈菌紅素也會溶于發(fā)酵液中,分離提取困難。同時,由于是次級代謝產(chǎn)物,靈菌紅素并不是一種純的物質(zhì),而是一種混合物,很難分離得到有效的成分。以上種種問題,都是限制靈菌紅素工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵之處。因此,解決這些問題將是科研工作者面臨的挑戰(zhàn)。同時,我們應(yīng)該相信在不久的以后,靈菌紅素必定能造福人類,改善人們的生活。但是</p><p>

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