乳酸菌胞外多糖硒化條件優(yōu)化【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　乳酸菌胞外多糖硒酸化條件優(yōu)化</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><p

2、>　　硒是生命活動的必需元素，在人類防癌抗癌、延緩衰老、提高機體免疫力、預(yù)防和治療心血管疾病和克山病等方面都發(fā)揮著重要作用。硒的存在形式有無機硒和有機硒兩種，相對而言有機硒毒性低、副作用小，能夠更好地發(fā)揮硒的生理活性。有機硒主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白和硒核酸等，其中硒多糖不但具有無機硒的多種活性，還具有多糖的各種生理功能，并且硒多糖的活性普遍高于硒和多糖，也更利于被機體吸收利用。因此對乳酸菌胞外多糖硒酸化條件優(yōu)化的研究是極有

3、意義的。</p><p>　　近年來對乳酸菌胞外多糖和硒活性的研究已經(jīng)較為深入，但對將乳酸菌胞外多糖與硒有機結(jié)合成為硒多糖的研究較少，而且硒多糖中硒含量也較少。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究的基本內(nèi)容：</b></p><p>　　硒酸化乳酸菌胞外多糖提取；

4、</p><p>　　乳酸菌胞外多糖的硒化；</p><p>　　硒酸化乳酸菌胞外多糖硒含量測定；</p><p>　　確定乳酸菌胞外多糖硒酸化的最優(yōu)條件。</p><p><b>　　擬解決的主要問題：</b></p><p>　　硒酸化乳酸菌胞外多糖的提取方法；</p><

5、p>　　硒酸化乳酸菌胞外多糖硒含量的測定方法；</p><p>　　影響硒酸化的主要因素的確定；</p><p>　　正交試驗的設(shè)計以及確定最優(yōu)條件。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p>　　四、研究的總體安排與進度：</p><p>　　2010.10—2010.11</p&g

6、t;<p>　　查閱相關(guān)文獻和資料，熟悉實驗基本操作</p><p>　　2011.2—2011.3</p><p><b>　　進行試驗</b></p><p><b>　　2011.4</b></p><p><b>　　撰寫論文</b></p>

7、<p><b>　　五、主要參考文獻：</b></p><p>　　[1] 楊潔彬,郭興華,張篪,等.乳酸菌-----生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1996:1-2.</p><p>　　[2] 凌代文.乳酸菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999:67-70.</p><p>　　[3] 鐘顏

8、麟,彭志英,趙謀明.乳酸菌胞外多糖的研究[J].中國乳品工業(yè),1999,27(4):7-9.</p><p>　　[4] 張英春,馮銳,曹維強.乳酸菌胞外多糖的合成及生理功能研究進展[J].中國甜菜糖業(yè),2008,(3):33-36.</p><p>　　[5] 劉先,康小紅,齡南.乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖的研究進展[J].中國乳業(yè),2010,2:46-48.</p><

9、p>　　[6] 李瑤喜,牟光慶.乳酸菌胞外多糖的生理功能及其在發(fā)酵乳中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā),2008,29(5):181-183.</p><p>　　[7] 顧笑梅,王富生,孔鍵,等.乳酸菌Z222產(chǎn)胞外多糖(EPSI)對免疫細胞功能的影響[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2003,23(6):442-445.</p><p>　　[8] Gabriel Vinderola

10、,Gabriela Perdig,Jairo Perdigon．Efects of the oral administration of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofociens on the gut mucosal immunity[J].Cytokine,2006,36:254-260.</p><p>　　[9] Amro

11、uche T,Boutin Y,Prioult G,et a1．Efects of bifidobacterial cytoplasm,cell wall and exopolysaccharide on mouse lymphocyte proliferation and cytokine production [J]．International Dairy Journal,2006,16:70-80.</p><

12、p>　　[10] 楊勇,劉會平.乳酸菌胞外多糖的研究進展[J].中國乳品工業(yè),2006,34(10):55-58.</p><p>　　[11] 劉宇,孟祥晨.乳酸菌胞外多糖及其抗腫瘤活性[J].中國乳品工業(yè),2008,36(1):39-43.</p><p>　　[12] 李全陽,夏文水.乳酸菌胞外多糖的研究[J].電子科技大學(xué)學(xué)報,2003,32(6):764-769.</

13、p><p>　　[13] 旭日花,李平蘭.乳酸菌胞外多糖研究新進展[J].中國乳品工業(yè),2009,37(12):41-45.</p><p>　　[14] 何瑩,李鵬.微量元素硒的研究進展及其對動物健康的影響[J].畜禽業(yè),2006,204(8):16-18.</p><p>　　[15] 鄒宇,于俊林,徐晶,等.硒及微生物富硒研究進展[J].食品研究與開發(fā),2006,

14、127(9):171-174.</p><p>　　[16] 史麗英,羅世煒.微量元素硒的研究進展[J].襄樊職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2005,4(1):108-110.</p><p>　　[17] 屈蘭竺,楊松杰,禚蘇,等.微量必需元素硒的作用探析[J].中國農(nóng)學(xué)通報2010,26(7):94-97.</p><p>　　[18] 姜小麗,秦毓茜.微量元素與人體健康[

15、J].中國科技信息,2007,11:202-203.</p><p>　　[19] 張兆琴,吳占福,吳淑琴,等.必需微量元素硒的研究進展[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2007,26(1):44-46.</p><p>　　[20] 高楠,陳維佳.微量元索硒與人類健康最新研究進展[J].沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,5(4):259～264</p><p>　　[21] 高學(xué)云,

16、張勁松,張立德.納米紅色元素硒的急性毒性和生物利用性[J].衛(wèi)生研究,2000,29(1):577-581.</p><p>　　[22] 凌翠,鐘武,李松.有機硒潛在藥物的研究進展[J].中國藥物化學(xué)雜志,2010,20(3):234-237.</p><p>　　[23] 崔喬,尚德靜,鄒霞.硒多糖的研究進展[J].中國生化藥物雜志,2003,(3):155-157.</p>

17、;<p>　　[24] 黃秀錦.富硒乳酸菌發(fā)酵條件的研究[J].中國調(diào)味品,2009,34(12):54-60.</p><p>　　[25] 艾連中,郭本恒,張灝.乳酸菌胞外多糖的研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2007,29(1):1-3.</p><p>　　[26] 張新宇,王雷.綠色巴夫藻硒多糖的提取[J].分離與純化,2000,31(6):643-646.</p

18、><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　乳酸菌胞外多糖硒酸化研究簡述</p><p>　　摘要：乳酸菌胞外多糖和硒對許多疾病都有防治作用，近年來對乳酸菌胞外多糖和硒活性的研究已經(jīng)較為深入，但對于將乳酸菌胞外多糖與硒有機結(jié)合成

19、為硒多糖的研究較少。其作為一種有機硒化合物，兼有乳酸菌胞外多糖與硒二者的活性，而且沒有無機硒毒性大的局限性，有重要的研究意義。</p><p>　　關(guān)鍵詞：乳酸菌胞外多糖 硒 硒酸化</p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　乳酸菌在代謝生長和產(chǎn)酸的過程會產(chǎn)生一種多糖類物質(zhì)，常稱為乳酸菌胞外多糖(Exopoly Sac

20、charides，EPS)。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外常滲于培養(yǎng)基的一類糖類化合物，有的依附于微生物細胞壁形成莢膜，稱為莢膜多糖；有的進入培養(yǎng)基形成粘液，稱為粘液多糖[1]。</p><p>　　乳酸菌胞外多糖具有調(diào)節(jié)胃腸道功能；調(diào)節(jié)免疫功能；抗腫瘤功能；對細胞體的保護作用；以及抗高血壓、抗氧化性、降低血清膽固醇等功能[2-8]。</p><p><b>

21、;　　2 硒</b></p><p>　　硒是氧族元素，它的化學(xué)性質(zhì)有很多地方與硫相似，是人體必需的一種微量元素，構(gòu)成若干抗氧化酶的活性中心，可影響機體抗氧化能力和相關(guān)疾病的抵抗能力。其存在形式有無機硒和有機硒兩種，常見的無機硒有亞硒酸鈉和硒酸鈉，有機硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒與人體健康有直接關(guān)系。大量實驗證明，硒參與多種酶的組成與代謝過程，具有防癌抗癌、延緩衰老、增強機體免疫力等生理功能。</

22、p><p>　　2.1 硒的生理功能</p><p>　　2.1.1 抗癌作用</p><p>　　硒被科學(xué)家稱之為人體微量元素中的“抗癌之王”[9]。大量研究表明，一個地區(qū)食物和土壤中硒含量的高低與癌癥的發(fā)病率有直接關(guān)系，如果該地區(qū)的食物和土壤中的硒含量高，癌癥的發(fā)病率和死亡率就低。</p><p>　　2.1.2 抗氧化作用</p>

23、;<p>　　硒是谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的組成成分，此酶的作用是催化還原性谷胱甘肽（GSH）與過氧化物的氧化還原反應(yīng)，所以可發(fā)揮抗氧化作用，是重要的自由基清除劑[10]。</p><p>　　2.1.3 防止糖尿病</p><p>　　硒是構(gòu)成谷胱甘肽過氧化物酶的活性成分，它能防止胰島β細胞氧化破壞，使其功能正常，促進糖份代謝、降低血糖和尿糖，改善糖尿病患者的癥狀

24、[11]。</p><p>　　2.1.4 防止心腦血管疾病</p><p>　　硒是維持心臟正常功能的重要元素，對心臟肌體有保護和修復(fù)的作用。人體血硒水平的降低，會導(dǎo)致體內(nèi)清除自由基的功能減退，造成有害物質(zhì)沉積增多，血壓升高、血管壁變厚、血管彈性降低、血流速度變慢，送氧功能下降，從而誘發(fā)心腦血管疾病的發(fā)病率升高，然而科學(xué)補硒對預(yù)防心腦血管疾病、高血壓、動脈硬化等都有較好的作用[12]。

25、2.1.5 防止克山病、大骨節(jié)病</p><p>　　缺硒是克山病、大骨節(jié)病、兩種地方性疾病的主要病因，補硒能防止骨髓端病變，促進修復(fù)，而在蛋白質(zhì)合成中促進二硫鍵對抗金屬元素解毒。對這兩種地方性疾病患者都有很好的預(yù)防和治療作用[13]。</p><p>　　2.1.6 增強機體免疫力作用</p><p>　　硒能有效地提高機體免疫水平已為較多試驗所證實，其作用包括細

26、胞免疫和體液免疫兩方面。硒還能增加免疫球蛋白的分泌，增加白細胞的吞噬和殺菌能力以及脾臟粘附細胞的抗原的能力，但硒如果過多時，也會導(dǎo)致機體免疫功能下降，機體合成抗體能力下降[14]。</p><p>　　2.1.7 其他功能</p><p>　　硒對視覺器官的作用極為重要，視網(wǎng)膜細胞、虹膜和晶狀體中均含有極為豐富的硒，補硒可改善視敏度，并阻止白內(nèi)障的形成[15]；硒還可用于解毒、排毒，硒與金

27、屬的結(jié)合力很強，能抵抗鎘對腎、生殖腺和中樞神經(jīng)的毒害。硒與體內(nèi)的汞、錫、鉈、鉛等重金屬結(jié)合，形成金屬硒蛋白復(fù)合而解毒、排毒[16]。</p><p>　　2.2 無機硒的局限性</p><p>　　無機硒具有蓄積性毒性和致突變作用，毒性較大、其安全劑量和毒性閥值之間只是一個很小的范圍，使用時劑量難以控制，應(yīng)用受到限制。而有機硒的毒性低，副作用小，不但能夠更好地發(fā)揮硒的作用，而且在激發(fā)免疫反

28、應(yīng)上比無機硒顯著。特別是生物態(tài)有機硒，毒性小，有利于人體吸收[17]。</p><p>　　3 乳酸菌胞外多糖硒酸化</p><p>　　硒多糖同無機硒相比，具有生物利用度高、生物活性強、毒性低、環(huán)境污染小等特點，是生物體將無機硒轉(zhuǎn)化成有機硒的有效形式之一。其作為一種有機硒化合物，兼有乳酸菌胞外多糖與硒二者的活性，研究證明，硒多糖的生物活性普遍高于多糖和硒，更易于為機體吸收和利用。乳酸菌在

29、其生長代謝過程中，可將無機硒與乳酸菌胞外多糖結(jié)合轉(zhuǎn)化為有機硒化合物，可使硒和胞外多糖的生理和藥理功能得到優(yōu)化[18]。</p><p><b>　　3.1 硒酸化方法</b></p><p>　　3.1.1 微生物富集硒多糖</p><p>　　微生物富集法獲取硒多糖，即在適宜的培養(yǎng)條件下將無機硒添加到真菌、藻類、細菌等的培養(yǎng)基中，通過微生物的

30、生長代謝，對硒進行富集和生物轉(zhuǎn)化，從面獲得硒多糖。目前，通過人工協(xié)迫富硒培養(yǎng)法成功獲得的硒多糖不僅硒含量較高，而且種類繁多，例如真菌類的靈芝硒多糖、香菇硒多糖、木耳硒多糖、金針菇硒多糖等；藻類的螺旋藻硒多糖、綠色巴夫藻硒多糖等[19]。</p><p>　　3.1.2 人工合成硒多糖</p><p>　　多糖含有多種基團，例如自由羥基、醛基或酮基，這些基團能夠與其它化合物發(fā)生特定的反應(yīng)，使

31、多糖的硒化修飾或合成成為可能。到目前為止，人工合成硒多糖主要有以下3種方式：一是在溫和條件下使用單體硒、亞硒酸或亞硒酸鈉等對多糖進行硒化修飾[20]；二是利用化學(xué)性質(zhì)活潑、具有酰氯結(jié)構(gòu)的SeOCL2[21,22]，作為硒化試劑；三是將含硒的功能基團接枝到多糖分子上[23]。</p><p>　　3.2 乳酸菌胞外多糖硒酸化優(yōu)化</p><p>　　首先通過單因素梯度試驗得出各因素水平范圍，

32、再對影響硒酸化效果的主要因素用做交試驗法，選出最佳的乳酸菌胞外多糖硒酸化條件[24]。</p><p>　　3.3 硒酸化乳酸菌胞外多糖的分離純化</p><p>　　硒多糖的分離純化方法與一般多糖的分離純化方法相似。通常用水或堿提取，經(jīng)乙醇沉淀后得到粗硒多糖。硒多糖再進行脫蛋白和脫色處理。脫蛋白可以采用Sevag法，或蛋白酶法。硒多糖脫色一般采用傳統(tǒng)的活性炭法和過氧化氫脫色法，該硒多糖經(jīng)

33、過DEAE-celloluse52、Sephadex、Sepharose柱色譜即可得到較純的硒多糖[25]。</p><p>　　3.4 多糖及硒含量測定</p><p>　　硒多糖中的多糖可用硫酸-苯酚法測定，硒含量可用分光度法測定[26]。</p><p><b>　　4 前景展望</b></p><p>　　硒酸化

34、乳酸菌胞外多糖兼有乳酸菌胞外多糖與硒二者的活性，而且應(yīng)用上沒有無機硒毒性大的局限性，對其的研究是非常必要和非常重要的。近年來對乳酸菌胞外多糖和硒活性的研究已經(jīng)較為深入，但對將乳酸菌胞外多糖與硒有機結(jié)合成為硒多糖的研究比較少。因此，需要在各方面做大量的工作，如：進一步探索結(jié)構(gòu)與功能之間的聯(lián)系；對各種功能進行深入研究；深化對作用機制的研究等。</p><p><b>　　參考文獻</b><

35、/p><p>　　[1] 鐘顏麟,彭志英,趙謀明.乳酸菌胞外多糖的研究[J].中國乳品工業(yè),1999,27(4):7-9.</p><p>　　[2] 張英春,馮銳,曹維強.乳酸菌胞外多糖的合成及生理功能研究進展[J].中國甜菜糖業(yè),2008,(3):33-36.</p><p>　　[3] 劉先,康小紅,齡南.乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖的研究進展[J].中國乳業(yè),2010

36、,2:46-48.</p><p>　　[4] 李瑤喜,牟光慶.乳酸菌胞外多糖的生理功能及其在發(fā)酵乳中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā),2008,29(5):181-183.</p><p>　　[5] 旭日花,李平蘭.乳酸菌胞外多糖研究新進展[J].中國乳品工業(yè),2009,37(12):41-45.</p><p>　　[6] 艾連中,郭本恒,張灝.乳酸菌胞外多糖的研

37、究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2007,29(1):1-3.</p><p>　　[7] 黃秀錦.富硒乳酸菌發(fā)酵條件的研究[J].中國調(diào)味品,2009,34(12):54-60.</p><p>　　[8] 楊勇,劉會平.乳酸菌胞外多糖的研究進展[J].中國乳品工業(yè),2006,34(10):55-58.</p><p>　　[9] 何瑩,李鵬.微量元素硒的研究進展及其對

38、動物健康的影響[J].畜禽業(yè),2006,204(8):16-18.</p><p>　　[10] 鄒宇,于俊林,徐晶,等.硒及微生物富硒研究進展[J].食品研究與開發(fā),2006,127(9):171-174.</p><p>　　[11] 史麗英,羅世煒.微量元素硒的研究進展[J].襄樊職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2005,4(1):108-110.</p><p>　　[1

39、2] 屈蘭竺,楊松杰,禚蘇,等.微量必需元素硒的作用探析[J].中國農(nóng)學(xué)通報2010,26(7):94-97.</p><p>　　[13] 姜小麗,秦毓茜.微量元素與人體健康[J].中國科技信息,2007,11:202-203.</p><p>　　[14] 張兆琴,吳占福,吳淑琴,等.必需微量元素硒的研究進展[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2007,26(1):44-46.</p>

40、<p>　　[15] 高楠,陳維佳.微量元索硒與人類健康最新研究進展[J].沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,5(4):259～264</p><p>　　[16] 高學(xué)云,張勁松,張立德.納米紅色元素硒的急性毒性和生物利用性[J].衛(wèi)生研究,2000,29(1):577-581.</p><p>　　[17] 凌翠,鐘武,李松.有機硒潛在藥物的研究進展[J].中國藥物化學(xué)雜志,201

41、0,20(3):234-237.</p><p>　　[18] 崔喬,尚德靜,鄒霞.硒多糖的研究進展[J].中國生化藥物雜志,2003,(3):155-157.</p><p>　　[19] 王艷預(yù),吳海歌,高大彬,等.硒多糖的研究進展[J].化學(xué)與生物工程,2008,25(1):7-9.</p><p>　　[20] 唐家駿.硒化角叉菜膠的制備及其理化性質(zhì)和生化活

42、性的研究[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報,1998,20(3):259-264.</p><p>　　[21] 龔曉鐘.硒化黃芪多糖與硒化葡聚糖的研究[J].深圳大學(xué)學(xué)報(理工版),1997,14(4):68-75.</p><p>　　[22] 龔曉鐘,歐陽政.硒化黃芪多糖制備條件及其結(jié)構(gòu)的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1998,10(2):26-31.</p><p

43、>　　[23] 蔣京,廖寶涼.N-含硒殼聚糖衍生物的合成、表征及其生物活性[J].廣東微量元素科學(xué),2000,7(5):14-17.</p><p>　　[24] Xia Guo,Xiang Zou, Min Sun.Optimization of extraction process by response surface methodology and preliminary characterizat

44、ion of polysaccharides from Phellinus igniarius. Carbohydrate Polymers[J].2010,80(3): 344–349.</p><p>　　[25] Gabriel Vinderola, Gabriela Perdigo´n, Jairo Duarte, et al. Effects of the oral administratio

45、n of the exopolysaccharide produced by Lactobacilluskefiranofaciens on the gut mucosal immunity[J]. Cytokine, 2006, 36, 254–260.</p><p>　　[26] 張新宇,王雷.綠色巴夫藻硒多糖的提取[J].分離與純化,2000,31(6):643-646.</p><p

46、><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　乳酸菌胞外多糖硒化條件優(yōu)化</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 引言12</b></p>

47、;<p>　　2 材料和方法13</p><p><b>　　2.1 菌種13</b></p><p>　　2.2 主要藥品和試劑13</p><p>　　2.3 主要儀器設(shè)備13</p><p>　　2.4 其他器材14</p><p>　　2.5 實驗步驟14<

48、/p><p>　　2.6 實驗方法14</p><p>　　2.6.1 乳酸菌胞外多糖發(fā)酵液制備14</p><p>　　2.6.2 乳酸菌胞外多糖提取14</p><p>　　2.6.3 乳酸菌胞外多糖硒化15</p><p>　　2.6.4 硒標準曲線的制備15</p><p>　　2

49、.6.5 硒多糖中硒含量測定15</p><p>　　2.6.6 硒化條件優(yōu)化15</p><p>　　3 結(jié)果與分析16</p><p>　　3.1 硒標準曲線16</p><p>　　3.2 單因素分析16</p><p>　　3.2.1 硒化劑添加量對硒化反應(yīng)的影響16</p><

50、p>　　3.2.2 反應(yīng)溫度對硒化反應(yīng)的影響17</p><p>　　3.2.3 反應(yīng)時間對硒化反應(yīng)的影響17</p><p>　　3.3 正交分析18</p><p>　　3.4 驗證實驗20</p><p><b>　　4 結(jié)論20</b></p><p><b>　

51、　5 展望20</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻21</b></p><p>　　附錄錯誤!未定義書簽。</p><p>　　摘要：本文對乳酸菌胞外多糖的硒化條件進行了研究。以硒多糖中的硒含量為指標，對反應(yīng)時間、硒化劑添加量、反應(yīng)溫度三個因素進行

52、了L9(34)正交實驗。實驗結(jié)果顯示，最佳條件為反應(yīng)時間14h、反應(yīng)溫度50.0℃、硒化劑添加量0.06 mg/ml。在此條件下，得到的硒多糖中硒含量為270.37μg/g。本實驗為其進一步研究奠定了基礎(chǔ)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：乳酸菌胞外多糖；硒化；優(yōu)化</p><p>　　Abstract：This paper,optimized the selenation reaction

53、conditions of EPS derived from Lactobacillus.The L9 (34) orthogonal experiment was applied to optimize the three key factors (reaction time, selenium addition, reaction temperature)for selenation reaction using the selen

54、ium content of selenation polysaccharide as the index. The results indicated that the optimal conditions for the selenation reaction were as the following:reaction time 14h,reaction temperature 50.0℃,selenium addition 0.

55、06mg/m</p><p>　　Keywords：EPS derived from Lactobacillus;selenation reaction;optimize</p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　硒是生命系統(tǒng)中重要的微量必需元素之一，不能在體內(nèi)合成，必須從食物中攝取。在生物體中，硒是谷胱甘肽過氧化物酶(

56、GSH-Px)、碘化甲(狀)腺氨酸及哺乳動物硫氧還蛋白還原酶(TrxR)的重要活性中心[1]。盡管硒在人體內(nèi)的含量非常少，而且每日攝入量也極微，但卻在人體的機能中發(fā)揮著極其重要的作用：硒是人體谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的重要組成部分，對清除體內(nèi)大量有害的脂質(zhì)過氧化物、延緩機體衰老有重要的作用[2]；含硒的GSH-Px能破壞體內(nèi)的一些環(huán)氧化物，阻斷環(huán)氧化活化途徑，改變致癌物的代謝方向，從而減少甚至消除致癌危險，因此硒也被科學(xué)家稱之

57、為人體微量元素中的“抗癌之王”[3]。同時，硒在防止糖尿病、防止心腦血管疾病、增強機體免疫力作用以及防止克山病和大骨節(jié)病這兩種地方性疾病等方面都發(fā)揮著重要的作用[4]。</p><p>　　但是，硒在地殼中含量不均，全球有40多個國家屬于低硒和缺硒地區(qū)，中國也是一個缺硒國家，全國有72%的人口存在不同程度的硒攝入不足[5]。因此有必要在食物中強化硒含量，向人體補充硒元素，做為防治硒缺乏引起各種疾病及保健的有效措施

58、。硒的存在形式有無機硒和有機硒兩種。無機硒具有蓄積性毒性和致突變作用，毒性較大、其安全劑量和毒性閥值之間只是一個很小的范圍，使用時劑量難以控制。作為補硒劑時，其應(yīng)用受到限制。而有機硒的毒性低，副作用小，不但能夠更好地發(fā)揮硒的作用，而且在激發(fā)免疫反應(yīng)上比無機硒顯著，較之無機硒可較好地消除對細胞膜穩(wěn)定方面的不利影響[6]。特別是生物態(tài)有機硒，毒性小，有利于人體吸收。</p><p>　　多糖作為生命物質(zhì)的組成成分之一

59、，廣泛存在于動物、植物和微生物中，它不僅為生物提供骨架結(jié)構(gòu)和能量來源，還廣泛參與細胞各種生理過程的調(diào)節(jié)。大量實驗證明，多糖具有多種多樣的生物學(xué)功能：多糖是一種很好的非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，它可通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、巨噬細胞、淋巴細胞等的作用，調(diào)節(jié)機體的免疫功能，提高宿主免疫能力，從而抑制腫瘤生長[7]；許多多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化等活性，起到保護生物膜和延緩衰老的作用[8]。除具有上述的多種生物活性功能外，多糖還具有

60、其他多種生物活性，如對病毒的抑制作用、降血糖和調(diào)血脂作用、抗輻射作用、抗?jié)冏饔玫萚9]。通過對多糖進行硒化得到的硒多糖，是一種有機硒化合物，不僅能有效克服無機硒的局限，還兼有多糖的生理功能，其生物活性普遍高于多糖和硒，更易于為機體吸收和利用，是一種較好的補硒劑[10]。</p><p>　　目前，多糖硒化主要有微生物富集法和人工合成兩種方法。微生物富集法獲取硒多糖，即在適宜的培養(yǎng)條件下將無機硒添加到真菌、藻類、

61、細菌等的培養(yǎng)基中，通過微生物的生長代謝，對硒進行富集和生物轉(zhuǎn)化，從面獲得硒多糖。根據(jù)此方法已成功獲得了多種硒多糖，例如：靈芝硒多糖[11]、香菇硒多糖[12]、紫球藻硒多糖[13]、螺旋藻硒多糖[14]、大蒜硒多糖[15]等。人工合成是指通過多糖上的某些基團例如自由羥基、醛基或酮基，與其它化合物發(fā)生反應(yīng)，使多糖進行硒化修飾或合成[16]。如在溫和條件下使用單體硒、亞硒酸或亞硒酸鈉等對多糖進行硒化修飾；或利用化學(xué)性質(zhì)活潑、具有酰氯結(jié)構(gòu)的S

62、eOCL2作為硒化試劑；或者將含硒的功能基團接枝到多糖分子上。</p><p>　　目前，國內(nèi)在乳酸菌胞外多糖硒化方面的研究相對較少。而乳酸菌是目前食品生產(chǎn)中普遍使用的菌種，其在免疫調(diào)節(jié)，保持消化道微生物菌群平衡，保護消化道感染等方面的保健功能和可靠的安全性已經(jīng)被廣大消費者所認可。乳酸菌在生長代謝過程中分泌的胞外多糖具有調(diào)節(jié)胃腸道功能；調(diào)節(jié)免疫功能；抗腫瘤功能；抗高血壓、抗氧化性、降低血清膽固醇等功能[17]。因

63、此本實驗，試圖通對乳酸菌胞外多糖硒化的研究，以尋求獲得最佳硒化條件，為進一步研究及開發(fā)做準備。</p><p><b>　　2 材料和方法</b></p><p><b>　　2.1 菌種</b></p><p>　　乳酸乳球菌亞種 由本實驗室篩選并保存</p><p>　　2

64、.2 主要藥品和試劑</p><p>　　硝酸（AR級）（1-30）</p><p><b>　　亞硒酸鈉（AR級）</b></p><p>　　鹽酸（0.1mol/l和1mol/l）</p><p>　　0.1%EDTA二鈉鹽溶液（稱量0.1gEDTA二鈉溶于蒸餾水中，并定容于100ml容量瓶中）</p>

65、<p>　　0.5%鄰苯二胺溶液（稱量0.5g鄰苯二胺溶于蒸餾水中，并定容于100ml容量瓶中）</p><p><b>　　雙氧水（AR級）</b></p><p><b>　　甲苯（AR級）</b></p><p><b>　　蒸餾水</b></p><p>　

66、　2.3 主要儀器設(shè)備</p><p>　　電熱恒溫水浴鍋 DK-8D型 上海一恒科技有限公司</p><p>　　湘儀離心機 H2500R-2 長沙湘儀離心機儀器有限公司</p><p>　　旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器

67、RE52-2 上海滬西分析儀器廠</p><p>　　紫外可見分光光度計 UV-6000型 上海元析儀器有限公司</p><p>　　立式壓力蒸汽滅菌器 LDZX-50KB 上海申安醫(yī)療器械廠</p><p>　　實驗室膜分離設(shè)備

68、 LNG-NF-101 上海朗極化工科技有限公司</p><p>　　玻璃儀器氣流烘干器 C型 鄭州杜甫儀器廠</p><p>　　電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 DHG-9108A型 上海精宏實驗設(shè)備有限公司</p><p>

69、　　電子天平 PL403 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司</p><p>　　超凈工作臺 蘇州科華凈化設(shè)備有限公司</p><p>　　真空冷凍干燥機

70、 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司通風(fēng)櫥</p><p><b>　　2.4 其他器材</b></p><p>　　錐形瓶、容量瓶、分液漏斗、玻璃棒、量筒、移液管、移液槍、燒杯、酒精燈、鑷子等。</p><p><b>　　2.5 實驗步驟</b></p><p>　　基本路線：胞外多糖發(fā)酵液→

71、離心去除菌體→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→乙醇沉淀（4℃冰箱過夜）→收集沉淀、洗滌→烘干→粗多糖→純化→硒化→硒多糖中硒含量測定</p><p>　　乳酸菌胞外多糖硒化條件優(yōu)化：單因素分析得出各因素水平范圍→正交試驗法找出乳酸菌胞外多糖硒化最佳條件→驗證實驗[18]</p><p><b>　　2.6 實驗方法</b></p><p>　　2.6.1 乳酸菌

72、胞外多糖發(fā)酵液制備</p><p>　　將乳酸乳球菌接種到本研究室改良的BLX培養(yǎng)基中即在培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上優(yōu)化了培養(yǎng)基成分，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，按0.3%的接種量活化兩次，培養(yǎng)12h后，即成為種子培養(yǎng)基；擴大培養(yǎng)的發(fā)酵條件是發(fā)酵溫度35℃，初始pH值為6.0，接種量，發(fā)酵時間為24h，即可得所需要的乳球菌產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵液。BLX培養(yǎng)基配方，見表1：</p><p>　　表1 BL

73、X培養(yǎng)基配方</p><p>　　Tab. 1 The BLX Culture medium</p><p>　　2.6.2 乳酸菌胞外多糖提取</p><p>　　提取步驟：乳酸菌培養(yǎng)液→離心去除菌體(5000r/min，20min)→去除蛋白→加雙氧水水浴脫色→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮→乙醇沉淀(4℃冰箱過夜)→收集沉淀→洗滌→乳酸菌胞外粗多糖→柱層析純化→冷凍干燥→精

74、制EPS。</p><p>　　具體操作：將乳酸菌的培養(yǎng)液用高速冷凍離心機下在5000r/min的條件下離心20min后取上清液，以去除菌體。去蛋白，再將pH調(diào)節(jié)為6-7，在調(diào)好pH的溶液中，加入五分之二左右體積的雙氧水，并在40℃-50℃中水浴2.5h-3.5h，其目的是脫色。再將溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，再加入濃縮液4倍體積的乙醇放在4℃冰箱過夜，讓多糖沉淀，將沉淀收集，并洗滌，得到的沉淀即為乳酸菌胞外粗多糖

75、，經(jīng)柱層析純化，進行冷凍干燥后，得到精制EPS[19]。</p><p>　　2.6.3 乳酸菌胞外多糖硒化</p><p>　　取0.3mg的乳酸菌胞外多糖粉末放入三角瓶中，加入體積分數(shù)為0.5%的硝酸水溶液10ml，加熱攪拌使多糖全部溶解，再經(jīng)水浴加熱到相應(yīng)的溫度，加入相應(yīng)量的Na2SeO3和BaCl2，，反應(yīng)相應(yīng)的時間后。冷卻到室溫，用Na2CO3調(diào)pH 5-6，加入適量無水Na2S

76、O3沉淀反應(yīng)液中的氯化鋇，用高速冷凍離心機下在5000r/min的條件下離心20min后取上清液，再用無水乙醇沉淀(4℃冰箱過夜)，收集沉淀，透析24h，冷凍干燥后，即為硒多糖。</p><p>　　2.6.4 硒標準曲線的制備</p><p>　　硒標準液配制：精密稱取亞硒酸鈉1g．置于100ml量瓶中用硝酸(1-30)溶解并定容至刻度，稀釋成含硒0.01g/ml的溶液，取1ml該溶液至

77、于100ml容量瓶中用硝酸(1-30)溶解并定容至刻度，稀釋成含硒100μg/ml的標準液。</p><p>　　硒標準工作液：吸取lmL硒標準溶液置于l00mL容量瓶。以0.1mol/l HCl溶液稀釋至刻度，混勻，得到的溶液每毫升相當于lμg硒。</p><p>　　精確量取硒標準工作液(1μg/mL)0.0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0和3.2ml(相當0.0、0.2、0.

78、4、0.8、1.6、2.0和3.2μg Se)，加20mL蒸餾水后，添加2ml 0.1%EDTA二鈉鹽溶液，再用1mol/l的HCl溶液調(diào)pH值至1.5-2.5，加2ml 0.5%鄰苯二胺溶液，搖勻，暗處放置40min。后添加10ml甲苯并搖動2min，靜置10min。取甲苯層，用1cm比色皿測定吸光度。標準溶液測定以不含Se對照品液的溶液為空白對照。平行測定3次。計算吸收度的平均值。紫外測定波長為335nm[20]。</p>

79、;<p>　　2.6.5 硒多糖中硒含量測定</p><p>　　將得到的硒多糖稱重。加入硝酸(1-30)，加熱使硒多糖溶解，并定容到100ml的容量瓶中，取1mL該溶液，加20mL蒸餾水后，添加2ml 0.1%EDTA二鈉鹽溶液，再用1mol/l的HCl溶液調(diào)pH值至1.5-2.5，加2ml 0.5%鄰苯二胺溶液，搖勻，暗處放置40min。后添加10ml甲苯并搖動2min，靜置10min。取甲苯層

80、，用1cm比色皿在波長335nm下測定吸光度。再根據(jù)得到的硒含量標準曲線，得到硒含量X(μg)，再算出硒多糖中硒含量。</p><p>　　硒含量(μg/g)= X(μg)×100/硒多糖質(zhì)量(g）</p><p>　　2.6.6 硒化條件優(yōu)化</p><p>　　針對乳酸菌胞外多糖硒化反應(yīng)中的硒化劑添加量、反應(yīng)溫度、反映時間三個主要影響因素，以硒多糖中的

81、硒含量為指標，首先通過單因素梯度試驗，在保持其他硒化條件不變的情況下，分析在各自單一變量條件下的最佳條件。根據(jù)這三個培養(yǎng)條件單因素分析的結(jié)果再進行正交實驗，分析確定最佳硒化條件。最后根據(jù)分析所得的最佳硒化條件進行驗證實驗。實驗中為減小誤差，每次實驗都做了3組平行，取平均值。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p><b>　　3.

82、1 硒標準曲線</b></p><p>　　用配制的硒標準系列溶液，用紫外分光光度計在波長335nm下測定吸光度，以吸光度為縱軸，硒含量為橫軸，以吸光度(Y)對硒含量(X，ug)進行線性回歸分析。得到回歸方程為：y=0.0557x+0.00480，相關(guān)系數(shù)R2=0.9956，如圖1所示：</p><p>　　圖1 硒含量的標準曲線</p><p>　　F

83、ig.1 The standard curve of Selenium content</p><p><b>　　3.2 單因素分析</b></p><p>　　3.2.1 硒化劑添加量對硒化反應(yīng)的影響</p><p>　　在保持反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間為6h不變的條件下，硒化劑添加量與硝酸添加量比為分別為0.02mg/ml、0.04mg/

84、ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.10mg/ml、0.12mg/ml六個水平進行實驗。將所得到的硒多糖，按照步驟2.6.5測定硒含量。以反應(yīng)液中硒化劑添加量為橫坐標，產(chǎn)物的硒含量為縱坐標繪制曲線圖，見圖2-1。</p><p>　　圖2-1 硒化劑添加量對硒化反應(yīng)的影響Fig.2-1 Effect of selenium addition on selenation reaction</p

85、><p>　　由圖2-1可知：在保持反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間為6h不變時，當硒化劑的加入量由0.02mg/ml增加至0.06mg/ml時，產(chǎn)物中硒含量顯著增加，增加輻度較大。而當硒化劑的加入量由0.06mg/ml增加到0.12mg/ml時，產(chǎn)物硒含量的增加不明顯，增加輻度呈減弱趨勢。綜合經(jīng)濟方面的考慮，硒化劑的加入量0.06mg/ml為此因素的最佳條件。</p><p>　　3.2.2 反應(yīng)

86、溫度對硒化反應(yīng)的影響</p><p>　　在保持硒化劑的添加量為0.06mg/ml，反應(yīng)時間為6h不變的條件下，反應(yīng)溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃六個水平進行實驗。將所得到的硒多糖，按照步驟2.6.5測定硒含量。以反應(yīng)溫度為橫坐標，以產(chǎn)物中硒含量為縱坐標繪制曲線圖，見圖2-2。</p><p>　　圖2-2 反應(yīng)溫度對硒化反應(yīng)的影響Fig.2-2 Effect

87、of temperature on selenation reaction </p><p>　　由圖2-2可知：在保持硒化劑的添加量為0.06mg/ml，反應(yīng)時間為6h不變的情況下，當溫度小于50℃時，隨著溫度的增加，產(chǎn)物中的硒含量逐漸增加。而當反應(yīng)溫度超過50℃時，產(chǎn)物硒含量則呈下降趨勢。反應(yīng)時間在14h時，產(chǎn)物中硒含量最高。因此，反應(yīng)溫度50℃為此因素的最佳條件。</p><p>　

88、　3.2.3 反應(yīng)時間對硒化反應(yīng)的影響</p><p>　　在保持硒化劑的添加量為0.06mg/ml，反應(yīng)溫度為50℃不變的條件下，反應(yīng)時間分別為2h、6h、10h、14h、18h、22h六個水平進行實驗。將所得到的硒多糖，按照步驟2.6.5測定硒含量。以反應(yīng)時間為橫坐標，以產(chǎn)物中硒含量為縱坐標繪制曲線圖，見圖2-3。</p><p>　　圖2-3反應(yīng)時間對硒化反應(yīng)的影響Fig.2-3

89、Effect of time on selenation reaction</p><p>　　由圖2-3可知：在保持硒化劑的添加量為0.06mg/ml，反應(yīng)溫度為50℃不變的情況下，當反應(yīng)時間在14h以內(nèi)時，隨著反應(yīng)時間的延長，產(chǎn)物中硒的含量呈上升趨勢；而當反應(yīng)時間超過14h時，產(chǎn)物硒含量則逐漸降低。反應(yīng)時間在14h時，產(chǎn)物中的硒含量最高。因此，反應(yīng)時間14h為此因素的最佳條件。</p><

90、p><b>　　3.3 正交分析</b></p><p>　　根據(jù)之前所做的分別針對硒化劑添加量、反應(yīng)溫度、反映時間影響硒化反應(yīng)的三個主要因素進行的單因素實驗結(jié)果，確定三因素三水平L9(34)的正交試驗中三個因素的設(shè)置分別為，硒化劑添加量：0.02mg/ml、0.06mg/ml、0.10mg/ml；反應(yīng)溫度：40℃、50℃、60℃；反映時間：10h、14h、18h。具體因素水平見表2：

91、</p><p>　　表2 正交因素水平表</p><p>　　Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment</p><p>　　按照三因素三水平L9(34)正交表的實驗設(shè)置進行9次實驗，實驗結(jié)果的直觀分析見表3，方差分析見表4：</p><p>　　表3 正交實驗結(jié)果和直觀分析</

92、p><p>　　Tab.3 Results of orthogonal experiments and visual analysis</p><p>　　表4 正交實驗方差分析表</p><p>　　Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiment </p><p>　　從表3的直觀分析中的極差數(shù)

93、據(jù)可知，本次實驗中針對硒化劑添加量、反應(yīng)溫度、反映時間這三個影響乳酸菌胞外多糖硒化反應(yīng)的主要因素中，影響乳酸菌胞外多糖硒化反應(yīng)的因素主次關(guān)系為：C（反應(yīng)時間）＞B（反應(yīng)溫度）＞A（硒化劑添加量）。表3中確定實驗的最佳硒化條件為：C2B2A2。也就是反應(yīng)時間為14h、反應(yīng)溫度為50℃、硒化劑添加量為0.06mg/ml。</p><p>　　另外，表4的方差分析表明乳酸菌胞外多糖硒化反應(yīng)中反應(yīng)時間對乳酸菌胞外多糖硒化

94、反應(yīng)有顯著的影響（α=0.10），硒化劑添加量和反應(yīng)溫度對硒化反應(yīng)不存在顯著的差異（α=0.10）。</p><p><b>　　3.4 驗證實驗</b></p><p>　　根據(jù)正交實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)分析得出的最佳硒化條件為C2B2A2，也就是反應(yīng)時間為14h、反應(yīng)溫度為50℃、硒化劑添加量為0.06mg/ml。這個實驗各因素水平的組合在正交試驗中沒有出現(xiàn)，須通過實際實

95、驗來驗證理論分析的結(jié)果，故做驗證實驗來進一步驗證正交實驗中得到的最佳條件是否可行。</p><p><b>　　表5 驗證實驗結(jié)果</b></p><p>　　Tab.5 The Result of Verification experiment</p><p>　　驗證實驗的3組平行實驗結(jié)果表明：反應(yīng)時間為14h、反應(yīng)溫度為50℃、硒化劑添加

96、量為0.06mg/ml的條件下，硒含量為270.37μg/g。此結(jié)果顯著大于正交實驗中的各個結(jié)果。這說明正交試驗分析得出的乳酸菌胞外多糖硒化最佳條件：C2B2A2，也就是反應(yīng)時間14h、反應(yīng)溫度50℃、硒化劑添加量0.06mg/ml是可行的。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　本實驗對乳酸菌胞外多糖硒化條件進行了優(yōu)化，在眾多乳酸菌胞外多

97、糖硒化反應(yīng)的影響因素中考察了硒化劑添加量、反應(yīng)溫度和反映時間三個因素。先在保持其他硒化條件不變的情況下，依次對各個因素進行單因素分析確定各自的最佳因素水平。然后根據(jù)單因素分析的結(jié)果合理設(shè)置了三因素三水平的L9(34)正交實驗。通過對正交實驗結(jié)果的分析，確定了影響乳酸菌胞外多糖硒化即影響硒化反應(yīng)得到的硒多糖中硒含量的因素主次關(guān)系為：C（反應(yīng)時間）＞B（反應(yīng)溫度）＞A（硒化劑添加量）。并且通過實際的驗證實驗表明最佳硒化條件為：反應(yīng)時間14h

98、、反應(yīng)溫度50℃、硒化劑添加量0.06mg/ml，在此硒化條件下，硒化反應(yīng)得到的硒多糖中硒含量為270.37μg/g。實驗中對硒化條件優(yōu)化，可確定乳酸菌胞外多糖硒化快速和節(jié)約成本的工藝，對其他多糖硒化的研究也有一定的幫助。</p><p><b>　　5 展望</b></p><p>　　硒元素是人類所必需的微量元素之一，對人體健康有著非常重要的做作用，同人體的健康有

99、著密不可分的關(guān)系。人體硒的主要來源是食物，但食物中硒含量普遍較低，無法滿足人體的需要。在當前硒攝入普遍不足的情況下，如何合理、安全地滿足人體的硒需要，是關(guān)系到億萬人民健康的大事。同時近年來，硒由于它在抗炎、防止心血管疾病、抗腫瘤、抗衰老以及治療神經(jīng)疾病相關(guān)等方面的應(yīng)用，已成為國內(nèi)外學(xué)者研究、開發(fā)的熱點[21]，并取得了很大進展。如目前已在進行臨床研究的含硒藥物依布硒林，它不僅抗氧化活性高，而且毒性極低，被公認為是GSH-Px的最佳模擬物

100、[22]。而硒多糖作為有機硒，兼有硒與多糖兩者的活性，更易于為機體吸收和利用，無疑具有廣闊的應(yīng)用前景。</p><p>　　雖然近年來對硒多糖的研究取得了較大的進展，其廣泛的生物活性和功能也逐漸被發(fā)現(xiàn)。但目前對于硒多糖的分離純化和生物活性方面研究較多，而其結(jié)構(gòu)測定，構(gòu)效關(guān)系以及多糖硒化方面的研究則相對滯后，還有很多不足。如通過富硒載培或微生物培養(yǎng)所得硒多糖硒含量不高；化學(xué)合成硒多糖中常使用大量的有機溶劑，產(chǎn)品既不

101、安全又容易污染環(huán)境，而且存在硒結(jié)構(gòu)相對單一等缺點。隨著硒多糖研究理論的完善、構(gòu)效關(guān)系的闡明、多糖硒化的不斷研究，硒多糖在各個領(lǐng)域?qū)玫礁訌V泛的應(yīng)用。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 凌翠,鐘武,李松.有機硒潛在藥物的研究進展[J].中國藥物化學(xué)雜志,2010,20(3):234-237.</p><p&

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