生化與分子變異作為魚類由殺蟲劑和重金屬污染物引起的氧化應(yīng)激損傷生物標(biāo)記研究.pdf

1、眾所周知，當(dāng)前已有越來越多的污染物進(jìn)入水體生態(tài)系統(tǒng)?？焖俚墓I(yè)化進(jìn)程和人口的激增已給環(huán)境帶來了嚴(yán)重威脅，并且已對包括人類在內(nèi)的各種生物的健康造成了直接影響。最主要的水體污染物是農(nóng)藥（例如污染河流和其他重要水體的有機(jī)磷農(nóng)藥）以及重金屬。環(huán)境中存在的這些污染物已在世界范圍內(nèi)成為社會和科學(xué)上的重大問題，且這些污染物能輕易造成水體污染，給包括魚類在內(nèi)的水生生物帶來重大損害。魚類是用于監(jiān)測環(huán)境污染物指示生物的典型代表，且在水生環(huán)境污染物潛在風(fēng)險評

2、價中擔(dān)任重要角色，還能反映水環(huán)境中污染物的生物學(xué)影響。此外，在水生生物中發(fā)生的污染物生物富集效應(yīng)可能會對野生動物和人類產(chǎn)生更高風(fēng)險。因此，有必要為評估農(nóng)藥和重金屬對環(huán)境破壞力確定一些評估參數(shù)，作為評估水生研究對象中生物累積和生態(tài)壓力的生物標(biāo)記。在過去的二十年里，“生物標(biāo)記”的使用主要在于生物化學(xué)、分子或組織學(xué)上的指示作用，或是用于更高組織水平上外源化合物暴露研究或其影響效應(yīng)的研究。
　　本研究運(yùn)用斑馬魚急性實(shí)驗(yàn)檢測和行為觀察，考察

3、除草劑“阿特拉津”（ATR）、有機(jī)磷農(nóng)藥“馬拉硫磷”（MAL）和重金屬鎘（Cd）對于魚類的毒性作用。急性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ATR、MAL和鎘的96小時半致死量分別為9.567，6.475和9.679mg.L-1。這表明魚類對MAL比對其他兩種毒物（ATR和鎘）更敏感。隨后，將斑馬魚暴露在三種毒物根據(jù)半致死量LC50計(jì)算的不同亞致死量濃度下（對照組:0；C1組:1/15th；C2組:1/10th以及C3組:1/5th）。斑馬魚體內(nèi)的ATR和M

4、AL濃度分別于第0天（24小時內(nèi)），第15天和第25天用高效液相色譜（HPLC）測定，同時用電感耦合等離子體質(zhì)譜測定鎘濃度。斑馬魚暴露在ATR的C3濃度下，ATR的最高BCF為13.589×104（24h），而暴露在MAL的C2濃度下最高BCF是11.271×103（24h）。結(jié)果表明，暴露在不同亞致死濃度下，MAL和ATR均可快速在魚體內(nèi)累積。而受試魚體內(nèi)的鎘濃度隨時間推移呈現(xiàn)出明顯的指數(shù)增長形式，并在第25天達(dá)到高峰。
　　斑

5、馬魚分別于低劑量和高劑量的ATR、MAL和鎘中暴露，第5和第25天在光學(xué)顯微鏡下觀察其大腦和骨骼肌的組織變化。組織病理學(xué)檢測顯示，暴露在ATR和MAL中，大腦組織會發(fā)生較低至中等程度的化學(xué)損傷。而從被試魚體內(nèi)多個區(qū)域的浦肯野細(xì)胞（Purkinje cells)惡化、神經(jīng)膠質(zhì)過多聚集區(qū)、壞死，以及由可見組織混亂而產(chǎn)生的一系列大腦病灶證據(jù)來看，鎘暴露對魚類的大腦產(chǎn)生了嚴(yán)重?fù)p傷，其損傷程度比ATR暴露更嚴(yán)重，而比MAL損傷更多。而在高劑量處理

6、25天這些大腦損傷非常明顯。同時，被ATR、MAL和鎘處理的魚類骨骼肌也發(fā)生了變化，其嚴(yán)重程度隨著時間和劑量的提升而加劇，可以觀察到不同程度的腫脹和嚴(yán)重壞死。
　　分別于毒物暴露后第5、10、15、20和25天測量魚體內(nèi)的乙酰膽堿酶（AChE）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性。在斑馬魚組織中，AChE的活性在中等濃度和最高濃度的ATR下均逐漸下降。而肌肉中AChE活性下降最大值為25.69％，出現(xiàn)在檢測到MAL

7、最高濃度后的第15天。而在各濃度的鎘處理中，AChE的活性在第5天首次分別降低至54.28％，48.59％和32.46％?？寡趸窩AT的活性會隨著ATR、MAL和鎘的暴露量及時間的推移而逐漸升高。另外，在所有ATR濃度下，肌肉和大腦中SOD活性在第10天和第15天升高，之后隨著時間推移逐漸下降。而暴露在MAL下時，斑馬魚組織中的SOD活性則隨著劑量提升及時間延長而升高。最后，在不同鎘濃度下處理25天，CAT活性有顯著升高（p<0.01

8、）。結(jié)果表明，長期暴露在有毒污染物中，酶的活性會受到明顯影響。
　　使用定量RT-PCR分析測定了不同毒物處理第5和第25天的斑馬魚組織中的乙酰膽堿酶（AChE）、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、過氧化氫酶（CAT）、環(huán)氧化酶-17（COX-17）、環(huán)磷酰胺1A（CYP1A）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）基因的mRNA水平。編碼這些抗氧化蛋白的基因，如Cu/Zn–SOD,Mn–SOD和COX-17的mRNA水平在斑馬魚暴露于不同

9、濃度的ATR和MAL中不同時間后并無顯著變化；而大腦和肌肉中CAT、GPx和CYP1A的基因轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比發(fā)生了顯著改變（p<0.01），這說明這些基因的轉(zhuǎn)錄因毒物暴露引起的氧化應(yīng)激而得到激活。同時，當(dāng)前研究顯示，更高的表達(dá)量出現(xiàn)在高劑量鎘（13.3倍）處理5天的斑馬魚肌肉中。有趣的是，結(jié)果顯示乙酰膽堿基因在腦中的表達(dá)量在不同濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥（ATR和MAL）處理5天后都有顯著提升。同時，鎘暴露后的乙酰膽堿基因表達(dá)顯示出隨著濃度上