電離輻射的分子生物學效應

1、?,第二章電離輻射的分子生物學效應,第一節(jié) DNA的電離輻射效應,?,?,?,?,輻射所致DNA損傷的類型：,DNA鏈斷裂、DNA 堿基損傷、DNA交聯(lián),一、DNA鏈斷裂,單鏈斷裂（single strand break，SSB)雙鏈斷裂（double strand break， DSB).,?,?,?,一、DNA損傷的種類,DNA鏈斷裂—單鏈斷裂（SSB）,雙鏈斷裂（DSB）,DNA交聯(lián)— DNA鏈交聯(lián),DNA-蛋白質交聯(lián)

2、,DNA二級和三級結構的變化,其中DSB是輻射所致生物學效應中最重要的原初損傷，而非重接性的DSB則被認為是細胞殺傷效應的最重要的損傷。,DNA鏈斷裂（DNA strand break),?單鏈斷裂（single strand break，SSB)：DNA雙螺旋,結構中一條鏈斷裂,?雙鏈斷裂（double strand break，DSB)：DNA雙螺,旋結構中兩條互補鏈于同一對應處或相鄰處同時斷裂,單鏈斷裂,雙鏈斷裂,?,1.

3、DNA鏈斷裂的分子機制,（1）脫氧戊糖和磷酸二酯鍵的破壞（直接）,三種自由基：eaq-，.OH，H.,DNA鏈斷裂主要與.OH作用有關，從脫氧戊,糖抽氫，形成了5中不同的反應產(chǎn)物。,.OH從脫氧戊糖中抽氫，主要作用于C(3’，5’），C（3’)上磷酸二酯鍵斷裂多余C（5’）端。,.OH攻擊糖基C(1’、2’、4’)形成堿不穩(wěn)定性位點（alkali labile sites,,ALS），這些位點在堿處理后發(fā)生鏈斷裂。,?,堿不穩(wěn)

4、定性位點（ ALS）,.OH對C（1’）， C（2 ’）， C,（3’）， C（4’）攻擊后的產(chǎn)物，在與,六氫吡啶供熱后都能導致DNA鏈的斷裂。所以，在DNA鏈上含有損失后經(jīng)堿處理后導致DNA鏈斷裂的位點，這些位點稱為堿,不穩(wěn)定性位點（ ALS）,?,?,?,?,?,?,?（2）堿基損傷 (base damage),1、充氧溶液中堿基損傷,嘧啶堿：羥自由基攻擊5、6位,腺嘌呤：羥自由基攻擊8位,鳥嘌呤：羥自由基攻擊4、5、8位,2、

5、細胞中堿基損傷,進展不大，用電子自旋共振儀,酶敏感位點(enzyme sensitive sites，,ESS）：堿基損傷可引起DNA雙螺旋的局部變性，特異的核酸內(nèi)切酶能識別和切除這種損傷，并通過酶的作用，產(chǎn)生鏈斷裂。這種特異性酶敏感位點稱為ESS。,無嘌呤或無嘧啶位點,（apurinic/apyrimidinic sites ， APS）：DNA鏈上損傷的堿基可被特異的DNA－糖基化酶除去或由于N－糖基鍵的化學水解而丟失，形

6、成,APS。形成APS在內(nèi)切酶的作用下形成鏈斷裂。,?,?,?,?,2.DNA鏈斷裂的主要特點,1)單鏈斷裂與雙鏈斷裂的比值,DSB約為SSB的1/10~1/20,SSB由一個自由基攻擊引起。,DSB必須由兩個以上自由基引起。,一定能量的射線所產(chǎn)生的SSB和DSB有一個大致的比值，但比值不是恒定的。,?,?,?,2）LET對鏈斷裂的影響,各種射線對鏈斷裂效應的順序：,中子＞γ射線、χ＞紫外線,SSB與DSB的比值與LET的高低有關。隨

7、著LET的升高，SSB減少，DSB增多。,?,?,?,?,?,3）氧效應對鏈斷裂的影響,氧效應可增加鏈斷裂的程度：,主要原因是氧效應可增加羥自由基的產(chǎn)生。,4）DNA鏈發(fā)生的部位,劑量不同，DNA堿基發(fā)生斷裂的概率亦不同。當劑量＜10Gy照射時，堿基斷裂順序G＞A＞T≥C。,當劑量＞ 40~80Gy照射時，堿基斷裂順序T＞G＞A≥C。,?,?,5）DNA鏈斷裂與細胞輻射敏感性,DNA的斷裂程度與輻射敏感性有關。,不同哺乳動物細

8、胞對輻射的敏感性有很大差異，平均致死劑量（D0）亦不同。,?,DNA自然斷裂的發(fā)生,通常情況下DNA斷裂的本底水平可達總DNA的百分之幾。一般方法難以測量，常引入凝膠模塊的方法來解決。,?,DNA交聯(lián)（DNA cross-linking),交聯(lián)種類,1、鏈間交聯(lián)：DNA雙螺旋結構中，一條鏈上的堿,基與其互補鏈上的堿基以共價鍵結合。,2、鏈內(nèi)交聯(lián)：DNA分子同一條鏈上的兩個堿基相,互以共價鍵結合,3、DNA－蛋白質交聯(lián)（DNA-

9、protein cross-linking ，DPC）：DNA與蛋白質以共價鍵結合,?,1.DNA-Protein cross-linking（DPC),1．DPC存在的證據(jù),小牛胸腺脫氧核糖核蛋白(DNP)在UV或γ射線照射后，其中DNA的不能被提取的部分隨著照射劑量的增加而增多，但如果用胰蛋白酶處理，則觀察到這部分DNA 。這是因為UV和γ射線照射導致了DNA與核蛋白的交聯(lián)，影響了DNP中DNA的提出，胰蛋白酶能夠裂解

10、DNA與蛋白質之間的共價鍵，消化DNP中的蛋白質部分．所以全部DNA都能被提取出來。,?,2、DPC形成的分子機制,羥自由基有關（?OH),DNA與蛋白質之間形成共價鍵的分子機制,1）輻射后蛋白質中的含硫氨基酸形成了自,由基。,2）蛋白質中的芳香族氨基酸形成酚型或酚氧型自由基，這類自由基在DPC中起著主要作用。,?,?,?,?3、影響DPC形成的因素,氧效應：如：紫外線＋O2→DPC↑,γ射線＋O2→DPC↓,溫度： 孵育（

11、45℃±）＋照射→DPC↑,特別是腫瘤細胞，已用于臨床,染色質的狀態(tài)：染色質結構愈緊，愈容易交聯(lián)。,細胞的不同周期，DPC不同。S期交聯(lián),最多，G1,G2期很少,?,?,?4、體內(nèi)DPC形成時DNA和蛋白質的選擇性,DNA的選擇性：具有轉錄活性的DNA。此處易發(fā)生SSB,單修復也快。,蛋白質的選擇性>：組蛋白、非組蛋白、調節(jié)蛋白、拓撲異構酶以及與復制轉錄有關的核基質蛋白。,組蛋白中H3>H4>H2A&

12、gt;H2B,?,?,?,?,2.DNA-DNA鏈間交聯(lián),在放射生物學中研究DNA-DNA鏈間的交聯(lián)的報道較少。,在干燥及含25%水的DNA中鏈間斷裂占優(yōu)勢；隨著水分子的增加DNA鏈斷裂生成率上升，而鏈間斷裂下降。,DAN 鏈間交聯(lián)多見于化學損傷，如氮芥、硫芥等；放射損傷時較少見到。,放射損傷時，DNA鏈間交聯(lián)與鏈斷裂相互競爭。,?,?,?,?,?,?,3.DNA鏈內(nèi)交聯(lián),多見于紫外線照射，電離輻射較少,二聚體形成是紫外線照射后

13、胸腺嘧啶自由基加合而成；是紫外線照射引起DNA的特征性改變。在DNA接近其最大吸收波長260nm,相鄰的嘧啶堿基共價交聯(lián)形成環(huán)丁烷四元環(huán)－嘧啶二聚體,此反應是可逆的。,分布是非隨機性的，相鄰的兩個T、或兩個C、或C與T間都連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體,?,DNA 二級和三級結構的變化,DNA變性：DNA雙螺旋結構解開，氫鍵斷裂，克原子磷消光系數(shù)顯著升高，出現(xiàn)了增色效應，比旋光性和粘度降低，浮力密度升高，酸堿

14、滴定曲線改變，同時失去生物活性。,1.增色效應和Tm值,Tm ：將DNA克原子磷消光系數(shù)ε（P）值達到,最高值1/2時的溫度稱之為熔解溫度（Tm),增色效應：隨DNA變性程度的增加，其克原子,磷消光系數(shù)值增大，這種現(xiàn)象稱增色效應。,r射線照射后的特點：,1、Tm值↓,2、增色效應有限，與鏈間交聯(lián)有關,?,2.旋光色散（optical rotatorydispersion,ORD)和圓二色性：,DNA的ORD光譜在228和229n

15、m波段有高峰，在257nm有低谷。,照射后，228和257nm發(fā)生與劑量呈線性的變化粘度：隨劑量的增加，粘度降低。,3. 粘度,DNA溶液粘度的改變可反映出DNA結構的改變。,?,?,二、DNA損傷的修復,亞致死損傷修復（sublethal,damage,repair,SLDR）：將預定的照射劑量分次給予，生物效應明顯減輕，表明在兩次照射間隔中細胞有所修復，這種修復稱作SLDR。潛在致死性損傷修復（potent

16、ially lethaldamage repair, PLDR)：照射后改變細胞所處的狀態(tài)和環(huán)境，如延長接種或給予不良的營養(yǎng)和環(huán)境條件，均能提高存活率。,?,?,?,不同類型DNA損傷的修復,1、DNA單鏈斷裂的修復,絕大多數(shù)正常細胞都能修復單鏈斷裂DNA修復與時間呈指數(shù)關系，修復速率依賴于溫度與SLDR有關,?,?,2、DNA雙鏈斷裂的修復,斷裂后即刻，細胞內(nèi)酶修復系統(tǒng)啟動。修復速率的快慢與水平的高低直接決

17、定損傷的殘留以及細胞的轉歸。（部分修復：早期修復快，隨后修復的慢）與PLDR有關,?,3、堿基損傷的修復,種類多，分析較困難,? 以嘧啶二聚體為模型，能修復但只,能部分修復。,?,4、DNA修復合成,DNA期外合成或程序外DNA合成,（unscheduled DNA,synthesis,UDS）：DNA合成適于損,傷后即刻，隨時間延長而增加，但與細胞周期沒有關系，是一種修復合成。,?,DNA的損傷修復機制,1、回復修復,細

18、胞對DNA的某些損傷可以用很簡單的方式加以修復在單一基因產(chǎn)物的催化下，一步反應就可以完成。這種修復方式叫回復。,?,?,1）酶學光復活,光復活酶或DNA光解酶,它的作用分成三個步驟：①酶與DNA中的二聚體部位相結合；②吸收波長為260～380 nm的近紫外光，酶被激活，使二聚體解聚；③酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復正常結構。,?,?,2）DNA單鏈斷裂重接,DNA單鏈斷裂中有一部分是通過簡單的重接而修復的，只需要一種酶——

19、DNA連接酶(ligase)參加，因此也屬于直接回復。,DNA連接酶能催化DNA雙螺旋結構中一條鏈缺口處的5’磷酸根與相鄰的一個3’羥基形成磷酸二酯健。連接所需的能量ATP(如動物細胞)。,?,?,?,3）嘌呤的直接插入,嘌呤插入酶,受損嘌呤→APS →插入嘌呤（糖苷鍵）,K+,糖基化酶 嘌呤插入酶,?,?,?,?,2、切除修復將損傷的部位（或連同其附近的一定部位）切除，然后用正確配對的、完好的堿基替代修復。

20、有多種酶和基因參與過程：識別（損傷位點 →切除→修復（補）連接,DNA連接酶,酶和蛋白質 DNA聚合酶,兩個特點:準確、正確修復。,?,?,?,?,1)堿基切除：,特點是切除受損傷的堿基。主要過程是水解受損傷的堿基與脫氧核糖磷酸鏈之間的N—糖苷鍵。反應由一類糖基化酶催化。,也即：糖基化酶→APS→內(nèi)、外切酶去除殘基。,整個修復過程可分以下幾步。,?,?,?,?,?,?,2）核甘酸切成（一段寡核苷酸）,首先由一個酶

21、系統(tǒng)識別損傷；,然后在損傷兩側各水解一個磷酸二酯鍵；釋放出一段寡核苷酸；填補缺損區(qū),連接酶重新完成連接。,?,3、多聚ADP-核糖的作用,ADP－核糖基多聚物的形成與存在是提高連接酶活性的重要因素，在DNA損傷修復,過程中起著重要作用。,?,?,4、損傷的“耐受”,DNA分子的損傷有時不能立即修復。特別是在復制已經(jīng)開始，而損傷又在復制叉附近時，細胞會通過另一些機制，使復制能進行下去，待復制完成后，再通過某種機制修復殘留

22、的損傷。復制時損傷并未消除，故稱,“耐受”。,包括重組修復（復制后修復）、SOS修復,?,?,1）、重組修復,當DNA雙鏈發(fā)生嚴重損傷時需要另一種機理來完成正確的修復。一種情況是兩條鏈同時受到損傷；另一種情況是單鏈損傷尚未修復時發(fā)生了復制，造成對應于損傷位置的新鏈缺乏正確模板；此時需要重組酶系將另一段未受損傷的雙鏈DNA移到損傷位置附近，提供正確的模板，進行重組。這便是重組修復。,?,?,?,2）SOS修復,細胞DNA受到損

23、傷或復制系統(tǒng)受到抑制，產(chǎn)生一種調控信號，解除對許多基因的抑制，這些基因的產(chǎn)物參與修復過程。,SOS修復過程是在損傷信號誘導下發(fā)生的，又稱可誘導的DNA修復。,修復過程容易發(fā)生錯誤，故又稱易錯修復。,?,?,?,?,?,4、錯配修復,錯配修復是生物維持生命、保持物種穩(wěn)定的—種重要功能。從細菌、酵母直至哺乳動物都普遍具有此修復機理。,在修復、重組的過程中或外界損傷因子的作用下都有可能發(fā)生錯配。在修復過程中首先要識別錯配堿基對。

24、,然后需要分辨錯配的哪一側屬于母鏈，哪一側屬于新合成的錯誤鏈。最后修復。,錯配糾正過程是很復雜的，至少需要10種活性因子參加。,基因組修復的不均一性,?,特點,1）轉錄活性DNA修復優(yōu)于靜止的基因2）轉錄鏈優(yōu)于非轉錄鏈－修復與轉錄偶聯(lián),?,?,1、重復序列中的DNA修復,靈長類細胞基因組中存在一種高度重復順序，在非洲綠猴細胞中此順序占總DNA的15％一,20％，堿基組成與總DNA相近，長度為172bP，沒有轉錄功能

25、。,?,?,2、活性基因中的修復,活性基因片段中二聚體的清除非?；钴S，如紫外線照射(20J2/M2)后8小時，已清除47%左右。,3、活性基因中轉錄鏈的修復,轉錄鏈優(yōu)先修復，其機制以轉錄修復偶聯(lián)因子的作用解釋。,DNA修復基因,1、原核細胞的修復基因占基因組總量1％。,2、酵母有三組RAD基因（radiation,sensitive 的前三個字母）,3、人類基因：1）XRCC （X-ray repaircross co

26、mplementing）基因；2）ERCC,?,?,?,?,?,三、DNA損傷與修復的生物學意義,DNA結構的完整與穩(wěn)定在生物學上有著特別重要的意義。,在射線作用下，DNA堿基的損傷或脫落改變了密碼，引起基因的突變。導致細胞的突變或轉化。雙鏈DNASSB能迅速修復，DSB經(jīng)原位重接很少，重組修復則易發(fā)生染色體畸變。,DNA交聯(lián)會影響核小體及更高層次的染色質結構，影響復制。,活性染色質的破壞影響基因的表達和調控。,?,?,?,?

27、,與DNA損傷修復有密切關系的另一個因素是真核細胞的染色質結構。而染色質包括：DNA、組蛋白、非組蛋白及少量RNA。,??,1.染色質2.核小體,常染色質:異染色質:,活性染色質非活性染色質(χ染色體),?,?,?,四、染色質損傷對DNA輻射效應的影響,一、染色質的輻射敏感性,染色質（chromatin)：真核細胞間期的核中DNA、組蛋白、非組蛋白以及少量RNA所組成的復合體。,染色

28、體（chromosome）：有絲分裂期，染色質的細纖絲高度壓縮，濃集成為光學顯微鏡下能看到的深染的結構。,染色質和染色體是細胞周期中不同的時期的兩種不同形態(tài)，化學本質是相同的。,?,?,?,?,?,?,1、染色質的結構與分類,染色質是由核小體的重復亞單位連接而成串珠,狀結構。,核小體由直徑為10nm×5.5nm的組蛋白核心和盤繞于此核心之外的DNA構成,組蛋白H2A，H2B，H3，H4各兩分子組成八聚體蛋,白，外繞DN

29、A長約200個堿基對,140個堿基對形成超螺旋結構，60個為連接區(qū)。,H1在連接區(qū)連接兩個核小體，起穩(wěn)定作用,?,?,?,常染色質與異染色質（eu-chromatin &hetero-chromatin）,常染色質纖絲折疊疏松，在細胞分裂間期著色微弱，其中含有單一和重復順序的DNA，能進行轉錄。,異染色質纖絲折疊緊密、在細胞分裂間期著色深，也含有重復和非重復順序的DNA，但都不能轉錄。,隨體DNA(Satellite

30、DNA）往往含有高度重復序,列，聚集于異染色質區(qū)，靠近著絲點。,?,?,常染色質和異染色質在化學性質上沒有什么差別，而可能是由于DNA核苷酸順序和折疊不同，導致染色質以兩種不同狀態(tài)存在。,活性染色質(active chromatin)：具有,轉錄活性的染色質,非活性染色質(inactive chromatin)：,不具有轉錄活性的染色質,2、核小體連接區(qū)的輻射效應,1、是合成RNA引物的起始部位，前者是DNA復制,的起始步驟,2、

31、連接區(qū)DNA是組蛋白H1的結合部位，組蛋白H1,的磷酸化與細胞分裂啟動有關。此區(qū)受輻射作,用使H1的磷酸化受抑制，影響細胞分裂。,3、連接區(qū)DNA易受DNase的攻擊。受照后更易。4、DNA修復合成從連接區(qū)開始,故連接區(qū)受到輻射后，意義更大！,3、染色質緊密程度對輻射敏感性的影響,4、活性染色質與非活性染色質的輻射敏,感性,二、染色質的輻射降解,1.機制,2.組織的輻射敏感性與復賽中降解程度3.蛋白酶在染色質降解中的作用,4.核酸

32、酶在染色質自身消化中的作用,三、染色質蛋白的輻射效應,1.組蛋白的輻射效應,2.非組蛋白的輻射效應,第五節(jié)細胞通信和細胞信號轉導的電離輻射效應,第五,?,?,蛋白質和酶的輻射生物效應,一、輻射對蛋白質和酶的結構和功能的影響,1、蛋白質的一級結構（primary stucture),肽鍵,1、多肽鏈的氨基酸殘基的排列順序2、基因上遺傳密碼的排列順序決定的3、通過肽鍵連接,即：每一種蛋白質分子都有自己特有,的氨基酸的組成和排列順序即

33、一級結構，由這種氨基酸排列順序決定它的特定的空間結構，也就是蛋白質的一級結構決定了蛋白質的二級三級等高級結構，這就是榮獲諾貝爾獎的著名的Anfinsen 原理。,蛋白質二級結構（secondary structure）,多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性結構的構象，是多肽鏈局部的空間結構（構象），主要有α－螺旋、β－折疊、β－轉角等幾種形式，它們是構成蛋白質高級結構的基本要素。,三級結構（tertiary st

34、ructure）主要針對球狀蛋白質而言是指整條多肽鏈由二級結構元件構建成的總三維,結構，包括一級結構中相距遠的肽段之間的幾何相互,關系,骨架和側鏈在內(nèi)的所有原子的空間排列。,球狀蛋白質，側鏈基團的定位是根據(jù)它們的極性,安排的,蛋白質特定的空間構象是由氫鍵、離子鍵、偶極,與偶極間的相互作用、疏水作用等作用力維持的，疏,水作用是主要的作用力。,有些蛋白質還涉及到二硫鍵。,四級結構（quaternary structure

35、）,四級結構是指在亞基和亞基之間通過疏,水作用等次級鍵結合成為有序排列的特定的,空間結構。,亞基通常由一條多肽鏈組成，有時含兩條以上的多肽鏈，單獨存在時一般沒有生物活性。,1、輻射對蛋白質結構和功能的影響,一級結構主要是肽鍵斷裂，其次巰基氧化、,二硫鍵還原、旁側羥基被氧化等。,高級結構主要是肽鍵氫鍵、側鏈氫鍵、,離子鍵和疏水鍵的改變。,一級結構的改變必然影響高級結構，導,致蛋白質的功能改變，酶活性改變。,?,?,?,二、輻射對蛋白質

36、和酶生物合成的影響,DNA→→→mRNA→→→Protein,輻射對DNA復制和轉錄的影響均可不同程度的影響蛋白質合成，對其翻譯過程產(chǎn)生效應。,抑制與激活并存,?,三、輻射對蛋白質分解代謝的影響,分解代謝增強：IR→細胞溶酶體破壞→組織蛋白酶釋放→Pr降解↑,? 蛋白質代謝產(chǎn)物↑,? 如：尿中肌酸、牛黃酸、尿素等↑,?,?,?,復習與思考,了解：2、4、5節(jié)熟悉：3和6節(jié)掌握：1節(jié),名詞解釋：DNA鏈的斷裂與交聯(lián)，回復修復，重