螺傳寄生蟲病及螺類感染檢測

1、螺傳寄生蟲病及螺類感染檢測,寄生蟲病研究所 陸紹紅,,ZHEJIANG ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES,創(chuàng)新 服務(wù),螺傳寄生蟲病血吸蟲病廣州管圓線蟲病華支睪吸蟲病并殖吸蟲病布氏姜片蟲病… …,螺類感染檢測病原學(xué)檢測：分子檢測： PCR LAMP,一、螺傳寄生蟲病,一、螺傳寄生蟲病,吸蟲主要特點(diǎn),蟲卵必須入水才能發(fā)育；生活史復(fù)雜，第一中間宿主多為淡

2、水螺。成蟲背腹扁平，具口、腹吸盤，寄生于人及哺乳動物體內(nèi)。囊蚴為感染期，經(jīng)口感染。吸蟲基本發(fā)育過程： 卵→多種幼蟲（毛蚴→胞蚴≡﹥雷蚴≡﹥尾蚴→囊蚴）→成蟲。,毛蚴 胞蚴 雷蚴 尾蚴 囊蚴,日本血吸蟲 Schistosoma japonicum,流行現(xiàn)狀：全球有76個國

3、家和地區(qū)有血吸蟲的流行，在我國主要分布在長江流域及以南12個省/自治區(qū)/直轄市，湖沼地區(qū)是我國目前最主要的血吸蟲病流行區(qū)。 2008年底,衛(wèi)生部、農(nóng)業(yè)部等聯(lián)合組織的全國血吸蟲病疫情現(xiàn)狀考評結(jié)果顯示,全國454個血吸蟲病流行縣(市、區(qū))人畜血吸蟲感染率均已降至5%以下,全部達(dá)到疫情控制標(biāo)準(zhǔn)。2010年全年急感報告病例數(shù)在50萬例以下，目前病人總數(shù)已降至40萬以下。防治策略：以傳染源控制為主的綜合防治流行因素：傳染源：病人、病牛等

4、。傳播環(huán)節(jié)：含蟲卵的糞便污染水源；水體中的釘螺；接觸含尾蚴的疫水。治療藥物：吡喹酮、青蒿素、蒿甲醚,六種寄生于人體的血吸蟲,日本血吸蟲（S．japonicum）曼氏血吸蟲（S．mansoni）埃及血吸蟲（S．haematobium）間插血吸蟲（S．intercalatum）湄公血吸蟲（S．mekongi）馬來血吸蟲（S．malayensis）,日本血吸蟲 曼氏血吸蟲 埃及血吸蟲 間插血吸蟲 湄公血吸蟲,日本血吸蟲生活

5、史,血吸蟲中間宿主—釘螺,山丘型釘螺 水網(wǎng)型釘螺 湖沼型釘螺 擬釘螺 細(xì)鉆螺 方格短溝卷 煙管螺,華支睪吸蟲 Clonorchis sinensis,病原：成蟲寄生在人體的肝膽管內(nèi)，又稱肝吸蟲。病變：主要表現(xiàn)為肝受損，膽管呈腺瘤樣病變，出現(xiàn)膽管炎、膽囊炎或阻塞性黃疸。嚴(yán)重時在門脈區(qū)出現(xiàn)纖維組織增生和肝細(xì)胞的萎縮變性，繼發(fā)肝硬化。分布：主要分布在亞洲，我國有25個省、市、自治區(qū)有不同程度流行。其中，廣

6、東省感染率相對較高。感染方式：食入生的或半生熟的含活囊蚴的淡水魚、蝦而感染；不良衛(wèi)生習(xí)慣，如抓魚后不洗手或用口叼魚；盛過生魚的器皿盛熟食物品等。治療：吡喹酮、阿苯達(dá)唑,華支睪吸蟲生活史,華支睪吸蟲第一中間宿主,并殖吸蟲 Paragonimus,病原：世界報道有50多種，中國有32個種2個型，以衛(wèi)氏并殖吸 蟲為代表的人獸共患型和以斯氏貍殖吸蟲為代表的獸主人次型。 分布：世界性分布，在我國27個省、市、自治區(qū)均有報道。

7、 感染方式：以各種方式食入生或半生的含活囊蚴的溪蟹或蝲蛄等。 臨床表現(xiàn): 1、亞臨床型（隱性感染） 2、急性并殖吸蟲病，常表現(xiàn)為全身過敏反應(yīng)、高熱、胸腹痛、氣促、肝大并伴有蕁麻疹等。 3、胸肺型并殖吸蟲病 最典型臨床表現(xiàn)：咳嗽、胸痛、咯血、痰帶腥味,并殖吸蟲致病,肺部蟲囊切片,肺吸蟲病人常誤診為肺腫瘤,并殖吸蟲生活史,并殖吸蟲中間宿主,放逸短溝蜷,方格短溝蜷,川蜷螺,布氏姜片吸蟲生活史,布氏姜片吸蟲中間宿主——扁卷螺,廣

8、州管圓線蟲 Angiostrongylus cantonesis,Female adult,Male adult,流行：主要流行于東南亞、太平洋島嶼、日本和美國等30多個國家和地區(qū)；我國的自然疫源地主要分布在浙江、福建、江西、湖南、廣東、廣西、海南和臺灣地區(qū)，多數(shù)呈散在分布。 目前全世界已有3000多病例報道，2006年在北京市發(fā)生的廣州管圓線蟲病暴發(fā)中，從6月24日發(fā)現(xiàn)首例病人至9月24日，北京市各醫(yī)院共確診

9、160例病人，其中138系因食涼拌福壽螺肉所致，此次本病暴發(fā)成為北京市的重大突發(fā)公共衛(wèi)生事件。我國已有9個省（自治區(qū)/直轄市）報告了廣州管圓線蟲病例，2008年底共計(jì)報告380多例，其中90%發(fā)生于群體感染。中間宿主：56余種，在我國發(fā)現(xiàn)的要有褐云瑪瑙螺、福壽螺和銅銹環(huán)棱螺。 2006~2007年全國廣州管圓線蟲病自然疫源地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，福壽螺、褐云瑪瑙螺和蛞蝓的平均感染率分別為6.8%、13.4%和6.5%。傳染源：最主要的是鼠類，以

10、褐家鼠和黑家鼠較為普遍。經(jīng)口感染：1）生食或半生生食螺類、魚、蝦、蟹等：爆炒或麻辣福壽螺、涼拌螺肉等為主要原因；2）幼蟲污染手或食物：用螺類喂養(yǎng)家禽或加工螺類的人員；3）生食蔬菜：陸地蝸?；蝌因跖肋^蔬菜時含幼蟲的分泌物可能粘在蔬菜上；4）飲生水：含幼蟲的中間宿主分泌物也可排入水中。,廣州管圓線蟲 Angiostrongylus cantonesis,廣州管圓線蟲生活史,廣州管圓線蟲第一中間宿主,福壽螺,褐云瑪瑙螺,銅銹環(huán)棱螺

11、,螺內(nèi)寄生蟲的病原學(xué)檢測,壓片法：逸蚴法：將單只釘螺置于指形試管內(nèi)，加脫氯水至試管口，用尼龍紗蓋好管口。置20～25℃、光照條件下，4～8 h后用放大鏡或解剖鏡在燈光下觀察指管水面有無血吸蟲尾蚴，必要時可用白金耳取表面水滴于載玻片，在鏡下觀察。 病理切片法：消化法：將螺體軟組織剪碎，按1g組織加25ml消化液（7g 胃蛋白酶，7ml HCl，1L ddH2O）的比例置于37 ℃孵育1h，適當(dāng)孔徑的分子篩過濾后鏡檢。組織勻漿鏡檢法

12、：螺肺囊鏡檢法：將福壽螺壓碎剔殼，沿外套膜的左側(cè)至后側(cè)的基部剪開，將外套膜向右翻開取外套膜的后半部分的約為24 mm × l6 mm大小的橢圓形囊狀結(jié)構(gòu)“肺囊”。然后剪開囊袋(雙層)兩邊沿，翻開囊袋呈單層后鋪平．光鏡觀察幼蟲結(jié)節(jié)（0.07mm*0.13mm~0.24mm*0.34mm大小，圓形或橢圓形的白色結(jié)節(jié)）。若囊袋層壁較厚，盡量拉平，或用解剖針撥動等手段觀察囊壁組織的幼蟲結(jié)節(jié)。,福壽螺肺囊鏡檢法,幼蟲結(jié)節(jié),,,螺內(nèi)寄生

13、蟲的分子檢測,傳統(tǒng)的螺內(nèi)病原學(xué)檢測操作繁雜；檢測結(jié)果存在一定的假陰性和假陽性；對一些輕度感染病原學(xué)診斷常會出現(xiàn)檢出率較低或者漏檢的情況。 PCR、LAMP等分子生物學(xué)方法的檢測操作簡便、快速；檢測靈敏度高、耗時短；適合于現(xiàn)場螺類病原體的檢測 。,1. Kumagai T, Furushima-Shimogawara R, Ohmae H, Wang TP, Lu S, Chen R, Wen L, Ohta N: De

14、tection of early and single infections of Schistosoma japonicum in the intermediate host snail, Oncomelania hupensis, by PCR and loop-mediated isothermal amplification assay. Am J Trop Med Hyg 2010, 83:542-548.2. Chen

15、 JH, Wen LY, Zhang XZ, Zhang JF, Yu LL, Hong LD: [Development of a PCR assay for detecting Schistosoma japonicum-infected Oncomelania hupensis]. Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi 2006, 24:204-207.

16、3. Vidigal TH, Magalhaes KG, Kissinger JC, Caldeira RL, Simpson AJ, Carvalho OS: A Multiplex-PCR approach to identification of the Brazilian intermediate hosts of Schistosoma mansoni. Mem Inst Oswaldo Cruz 2002, 97 Su

17、ppl 1:95-97.4. Wei FR, Liu HX, Lv S, Hu L, Zhang Y: [Multiplex PCR assay for the detection of Angiostrongylus cantonensis larvae in Pomacea canaliculata]. Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi 201

18、0, 28:355-358.5. 魏紀(jì)玲, 周衛(wèi)川, 邵碧英, 余書生, 王壽昆, 陳文炳, 陳壽鈴: PCR檢測螺類感染廣州管圓線蟲方法的建立與應(yīng)用. 中國人獸共患病學(xué)報 2008, 24:1136-1140.,螺內(nèi)廣州管圓線蟲、血吸蟲的PCR檢測,野外采集小管福壽螺172只，肺檢法檢測后，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。多重PCR的敏感性為93.8%(45／48)，特異性為80.6％(100／124)。多重PCR法的陽性檢出率為40.

19、1％(69／172)；肺檢法的陽性檢出率為27.9％(48／172)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。,小管福壽螺中廣州管圓線蟲III期幼蟲的PCR檢測,Loop-Mediated Isothermal Amplification （LAMP）method,Target gene (DNA or RNA)Primers （FIP, F3, BIP, B3）DNA Polymerase with strand displacement ac

20、tivitydNTPsBuffer solutionRTase (for RNA),,65℃, 15 – 60 min.,Detection,SimpleRapid (high efficiency)Specific (high specificity)Cost effective,,August, 2011,Papers about LAMP in the world,August, 2011,,,,,LAMP deve

21、loped in parasites study,螺內(nèi)廣州管圓線蟲、血吸蟲的LAMP檢測,1.Kumagai T, Furushima-Shimogawara R, Ohmae H, Wang TP, Lu S, Chen R, Wen L, Ohta N: Detection of early and single infections of Schistosoma japonicum in the intermediate hos

22、t snail, Oncomelania hupensis, by PCR and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay. Am J Trop Med Hyg 2010, 83:542-548.2.Chen R, Tong Q, Zhang Y, Lou D, Kong Q, Lv S, Zhuo M, Wen L, Lu S: Loop-mediated isoth

23、ermal amplification: rapid detection of Angiostrongylus cantonensis infection in Pomacea canaliculata. Parasit Vectors 2011, 4:204. 3. Liu CY, Song HQ, Zhang RL, Chen MX, Xu MJ, Ai L, Chen XG, Zhan XM, Li

24、ang SH, Yuan ZG, et al: Specific detection of Angiostrongylus cantonensis in the snail Achatina fulica using a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay. Mol Cell Probes 2011, 25:164-167.,Design of primers for

25、the LAMP method,,Target DNA: Sj28S rDNA Primers: FIP、 BIP、 F3、 B3,Protocal of the LAMP method,Detection,Result of Sensitivity and Specificity,LAMP和PCR群體檢測結(jié)果的比較,,,,,,,,,LAMP檢測試劑盒開發(fā)應(yīng)用前景,優(yōu)勢：簡易快速、靈敏特異；結(jié)果可視；體系穩(wěn)定；專利保護(hù)。,,推