顯微鏡技術(shù)

1、顯微鏡技術(shù),目錄,,,,,目的要求及原理,,試劑和器材,,,,,顯微鏡使用方法和注意事項,,相關(guān)理論知識,顯微鏡是由一個透鏡或幾個透鏡的組合構(gòu)成的一種光學儀器，是人類進入原子時代的標志。主要用于放大微小物體成為人的肉眼所能看到的儀器。 顯微鏡的歷史：最早的顯微鏡是荷蘭的眼鏡商詹森（Z.Jansen1588-1628）于1604年制造。半個多世紀后，英國物理學家胡克（R.Hooke1663-1703）制造了第一臺具有科學價值

2、的顯微鏡，他首次觀察到木栓的顯微圖象，發(fā)現(xiàn)了細胞。真正觀察到活細胞的是荷蘭科學家列文虎克（Antonie Van Leeuwenhoek1632-1723），他用自制的顯微鏡觀察到池塘中的原生動物、細菌等。1931年，恩斯特·魯斯卡通過研制電子顯微鏡，使生物學發(fā)生了一場革命。這使得科學家能觀察到像百萬分之一毫米那樣小的物體。1986年他被授予諾貝爾獎。,相關(guān)理論知識,一、顯微鏡的分類,1、光學顯微鏡 利用光學原理，把人

3、眼所不能放大的微小物體放大成像的儀器（1）可見光顯微鏡 利用光譜的可見光部分（390-760nm）成像的顯微鏡（2）不可見光顯微鏡 分為紫外光顯微鏡（390nm以下的紫外光）、紅外光顯微鏡（760nm以上的紅外光）和X射線顯微鏡等2.電子顯微鏡 電子顯微鏡簡稱電鏡，是根據(jù)電子光學原理，用電子束和電子透鏡代替光束和光學透鏡，使物質(zhì)的細微結(jié)構(gòu)在非常高的放大倍數(shù)下成像的儀器。,,可見光顯微鏡分類,1 根據(jù)顯微鏡的照明技術(shù)

4、分為明視野顯微鏡、暗視野顯微鏡和熒光顯微鏡等2 根據(jù)顯微鏡的成像技術(shù)分為相差顯微鏡、干涉顯微鏡、微分干涉反差顯微鏡和偏光顯微鏡等3 根據(jù)顯微鏡的構(gòu)造可以分為倒置顯微鏡、實體顯微鏡和比較顯微鏡等4 近年來又制造出激光掃描顯微鏡等,體視顯微鏡,熒光倒置顯微鏡,倒置顯微鏡,生物顯微鏡,生物顯微鏡,生物顯微鏡,二、明視野顯微鏡,明視野顯微鏡是最通用的光學顯微鏡，以透射光（日光或人工光源）照明，標本中的各點根據(jù)光吸收的不同在明亮的背景中成像

5、，稱為明視野顯微鏡。人的眼睛對光波的顏色（波長）和光波的強度（振幅）能夠感覺，所以，經(jīng)過染色的各種生物樣品是明視野顯微鏡的主要觀察對象。 顯微鏡的構(gòu)造與原理：光學系統(tǒng)和機械系統(tǒng),,,,,,,,,顯微鏡的光學系統(tǒng),顯微鏡的光學系統(tǒng),（1）目鏡：一般由兩塊或兩塊以上的平凸透鏡組合而成。上面與眼接觸的叫接目透鏡，下面的叫視野透鏡。兩者之間或視野透鏡下面有一個金屬圓環(huán)叫光闌。在光闌上可以安裝目鏡測微尺，有時可將毛發(fā)粘在光闌上做成指針。,

6、目鏡的放大倍數(shù),每臺顯微鏡裝有不同放大倍數(shù)的目鏡，常以5X、10X、15X等字樣標明 目鏡的放大倍數(shù)（M）可用下式計算：M=250mm（明視距離）/fmm（目鏡焦距），其中明視距離指從眼睛晶狀體到目鏡所放大的虛象之間的距離，一般為250mm。 顯微鏡的分辨力和鏡像亮度有關(guān)系，而鏡像亮度又與目鏡放大倍數(shù)相關(guān)，即目鏡放大倍數(shù)越高，鏡像亮度越低。所以要達到相同的放大倍數(shù)如200倍，可采用10x的目鏡與20x的物鏡配合，也可采

7、用20x的目鏡和10x的物鏡配合，但是提高分辨力最好選擇前者。,（2）物鏡： 物鏡的放大倍數(shù)：5x至20x為低倍鏡，40x至80x為高倍鏡，90x至100x為油鏡。物鏡的放大倍數(shù)（W）：W=160mm（光學筒長）/fmm（物鏡焦距），光學筒長是指物鏡上、下焦點平面之間的距離，一般的為100mm，也有的長170mm。 物鏡的數(shù)值孔徑，又稱鏡口率，常用NxA或A表示。數(shù)值孔徑越大吸光量越多，分辨力越高。NxA=nxsina

8、/2（n是指物鏡與標本之間介質(zhì)的折射率；a指鏡口角。,馬鈴薯淀粉顆粒4倍鏡下觀察圖片,馬鈴薯淀粉顆粒4倍鏡下觀察圖片,馬鈴薯淀粉顆粒10倍鏡下觀察圖片,馬鈴薯淀粉顆粒40倍鏡下觀察圖片,（3）聚光器及集光器 聚光器是由聚光鏡、孔徑光闌、濾光鏡等組成。用途：將光線集合成束，增加照明度，提高物鏡分辨力。集光器是由集光鏡和視場光闌組成。（4）光源 顯微鏡的照明光源有天然光源和人工光源兩種。天然光源，即利用太陽光，最好是白

9、云反射出來的光，一般不用直射光，必要的時候要加濾光片或毛玻璃，以免影響觀察效果和損壞眼睛。人工光源，如顯微鏡燈，日光燈，臺燈等。要求是光源強且穩(wěn)定，最好強度能調(diào)節(jié)；發(fā)光的顏色要適宜，最好能近似天然白光；光源發(fā)熱不能過多，尤其是活體觀察要防止高溫造成標本死亡，所以一般要放濾光片。,（5）濾光器,用顯微鏡觀察標本或進行攝影時，往往要選擇某一波段的光線，而排除不需要的光線；或者由于光線太強需要減弱；要達到這些目的就要在光源和聚光器之間安置適宜

10、的濾光器。濾光器的種類有兩種：濾光片和液體濾光器。最簡單常用的是濾光片。濾光片根據(jù)制造方法的不同可分為有色玻璃濾光片、中性濾光片和干涉濾光片,顯微鏡的機械裝置,,,,,,,,,載物臺,鏡座,物鏡轉(zhuǎn)換器,鏡筒,鏡臂,調(diào)焦裝置,顯微鏡的機械裝置,（1）鏡座：又稱鏡腳是顯微鏡的基座，用以支持整個鏡體的穩(wěn)定。有的顯微鏡在鏡座內(nèi)有照明光源或反光鏡。（2）鏡臂：支持鏡筒、載物臺、聚光器和調(diào)焦裝置等。（3）載物臺：又稱鏡臺或標本臺，附著于鏡臂下端

11、上部的鏡臺附著器。臺面與顯微鏡光軸垂直，它是支持被檢物體的平面。臺中央有一個通光孔。臺上有標本夾，有的裝有標本移動器。載物臺可分為移動式和固定式。,（4）鏡筒：金屬制的圓筒，附著于鏡臂上部，其上端放置目鏡，下端連接物鏡轉(zhuǎn)換器。在設(shè)計上目鏡、鏡筒和物鏡的中心必須必須在同一條直線上。安裝目鏡的鏡筒有單筒和雙筒兩種，雙筒的兩者之間距離可以調(diào)節(jié)，以適應(yīng)人的眼距。雙筒之中有一個目鏡鏡筒裝有屈光度調(diào)節(jié)器，便于兩眼視力不同的觀察者。（5）物鏡轉(zhuǎn)換器

12、：固著于鏡筒的下端，可自由旋轉(zhuǎn)，更換物鏡。當他們轉(zhuǎn)到工作位置時即與光軸合軸。安裝物鏡時要把鏡筒提高，以防止鏡頭碰到載物臺。轉(zhuǎn)換物鏡要用手指捏緊轉(zhuǎn)換蝶，而不要推物鏡，防止破壞合軸。,（6）調(diào)焦裝置：為了得到清晰的物像，必須調(diào)節(jié)物鏡與標本之間的距離，使它與物鏡的工作距離相等，這種操作叫做調(diào)焦。粗調(diào)螺旋 粗調(diào)螺旋用于粗放調(diào)節(jié)物鏡和標本的距離，老式顯微鏡粗調(diào)螺旋向前扭，鏡頭下降接近標本。新近出產(chǎn)的顯微鏡(如Nikon顯微鏡)鏡檢時，右手向前

13、扭動使載物臺上升，讓標本接近物鏡，反之則下降，標本遠離物鏡。 微調(diào)螺旋 用粗調(diào)螺旋只能粗放地調(diào)節(jié)焦距，難于觀察到清晰的物像，因而需要用微調(diào)螺旋做進一步調(diào)節(jié)。微調(diào)螺旋每轉(zhuǎn)一圈鏡筒僅移動0.1 mm(100μm)。新近出產(chǎn)的研究顯微鏡的粗調(diào)螺旋和微調(diào)螺旋是共軸的。,顯微鏡的分辨率,顯微鏡的分辨率是指顯微鏡的最小分辨距離，即顯微鏡將物體放大成像后，能將物體相近兩點分辨清楚的極限距離，通常用D表示。它與物鏡的數(shù)值孔徑成反比，與光波長度成正比

14、。公式為：D=0.16入/NxA 入為光波波長。 NxA 為物鏡數(shù)值孔徑。D越小，顯微鏡的分辨率就越高。,顯微技術(shù),生物顯微技術(shù)是指在顯微鏡下對生命有機體的微觀世界進行定性觀察（辨別顏色、形狀、質(zhì)地）、定量描述（測量、計數(shù)、繪圖）以及細微結(jié)構(gòu)的解剖等技術(shù)的總稱,目的要求及原理,目的：了解普通光學顯微鏡的構(gòu)造與原理，掌握明視野顯微鏡的使用方法。 原理：以透射光入射，顯微鏡有兩種照明方式：一種是臨界照明，燈絲經(jīng)一個聚光器后，其像

15、呈在標本平面上，因此對標本的照明是不均勻的。另一種照明方式為柯拉（柯勒）照明，照明光路中的光學組件包括光源、集光器、視場光闌、孔徑光闌、聚光器和物臺?？吕彰鞅扰R界照明優(yōu)越：其一是照明均勻，其二是通過調(diào)節(jié)視場光闌的大小和位置可以控制標本平面上照明區(qū)的大小和位置。當只需要觀察或測量標本的一部分時，可以關(guān)小視場光闌，減小照明區(qū)域，使標本的其它部分不受熱，并減少了雜散光的干擾。,試劑和器材,1、材料：標本裝片(草履蟲)2、器材：顯微鏡,顯微

16、鏡使用方法和注意事項,1.觀察前的準備(1)顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內(nèi)拿出時，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡搬運到實驗桌上(2)將顯微鏡放在自己身體的左前方，離桌子邊緣約lOcm左右，右側(cè)可放記錄本或繪圖紙(3)調(diào)節(jié)光照。對于不帶光源的顯微鏡，可利用燈光或自然光通過反光鏡來調(diào)節(jié)光照，但不能用直射陽光，直射陽光會影響物像的清晰并刺激眼睛。將10×物鏡轉(zhuǎn)入通光孔，將聚光器上的虹彩光圈打開到最大位置，用左眼觀察目

17、鏡中視野的亮度，轉(zhuǎn)動反光鏡使視野的光照達到最明亮最均勻為止。光線較強時，用平面反光鏡，光線較弱時，用凹面反光鏡。對于自帶光源的顯微鏡，可通過調(diào)節(jié)電阻旋鈕來調(diào)節(jié)光照強弱,(4)光軸中心調(diào)節(jié)。顯微鏡在觀察時，其光學系統(tǒng)中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光闌的中心必須跟顯微鏡的光軸同在一直線上。使用帶視場光闌的顯微鏡時，先將光闌縮小，用10×物鏡觀察，在視場內(nèi)可見到視場光闌球形多邊形的物像。如此像不在視場中央，可利用聚光器外側(cè)的兩

18、個調(diào)整旋鈕將其調(diào)到中央，然后緩慢地將視場光闌打開，能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌的多邊形物像完全與視場邊緣內(nèi)接，說明光線已經(jīng)合軸。,鏡檢任何標本都要養(yǎng)成必須先用低倍鏡觀察的習慣。因為低倍鏡視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目標和確定檢查的位置。 將標本片放置在載物臺上，用標本夾夾住，移動推動器，使被觀察的標本在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)旋鈕，使物鏡調(diào)至接近標本處，用目鏡觀察并同時粗調(diào)節(jié)旋鈕慢慢升起載物臺(或下降鏡筒)，直至物像出現(xiàn)，再

19、用細調(diào)節(jié)旋鈕物像清晰為止。用推動器移動標本片，找到合適的標本物像并將它移到視野中進行觀察。,2．低倍鏡觀察,3．高倍鏡觀察 在低倍物鏡觀察的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)換高倍物鏡。較好的顯微鏡，低倍、高倍物鏡同焦的，在正常情況下，高倍物鏡的轉(zhuǎn)換不應(yīng)碰到載玻片或其上的蓋玻片。若使用不同型號的物鏡，在轉(zhuǎn)換物鏡時要從側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后目鏡觀察，調(diào)節(jié)光照，使亮度適中，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使載物臺上升(鏡筒下降)，直至

20、物像出現(xiàn)，再用細調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至物像清晰為止，找到需觀察的部位．并移至視野中央進行觀察。,4．油鏡觀察 油浸物鏡的工作距離(指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離)很短，一般在O.2 mm以內(nèi)，再加上一些光學顯微鏡的油浸物鏡沒有“彈簧裝置”，因此使用油浸物鏡時要特別細心，避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標本片并使物鏡受損。 使用油鏡按下列步驟操作：(1)先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺下降(或?qū)㈢R筒提升)約2cm，并將高倍鏡轉(zhuǎn)出。(

21、2)在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。(3)從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺緩緩地上升，(或鏡筒下降)，使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標本接觸。,(4)從接目鏡內(nèi)觀察，放大視場光闌及聚光器上的虹彩光圈(帶視場光闌油鏡開大視場光闌)，上調(diào)聚光器至頂位，使光線充分照明。用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺徐徐下降(或鏡筒上升)，當出現(xiàn)物像一閃后改用細調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至最清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物像，必須再從側(cè)面觀察，重復上述操作。(5)觀

22、察完畢，下降載物臺，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚乙醇混合液(乙醚2份，無水乙醇3份)或二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭2～3下即可(注意朝一個方向擦拭)。,(6)將各部分還原，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍物鏡與載物臺通光孔相對，再將載物臺下降至最低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個干凈罩子將接目鏡罩好，以免目鏡頭沾污灰塵。最后用柔軟紗布清潔載物臺等機械部分，然后將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中 。,