急性毒性試驗設計

1、急性毒性試驗設計,組員：程旺、高思杰、后若蘭 高陽、陳剛,一、急性毒性,急性毒性指人或動物一次或24 h之內多次接觸外源化學物后，在短期內所發(fā)生的毒性效應，包括致死效應。,一次：指瞬間給實驗動物染毒，如經(jīng)口、經(jīng)靜脈注射染毒。24 h之內多次：指外源化學物毒性過低，需給予動物較大劑量。,急性毒性效應出現(xiàn)的快慢和毒性反應的強度與外源化學物的性質和染毒劑量的大小有關。 如：丙烯腈，過氧化二碳酸二環(huán)己酯,

2、丙烯腈經(jīng)口急性毒性試驗設計,實驗目的,評價丙烯腈的毒性作用，求出半數(shù)致死量LD50，并根據(jù)LD50進行急性毒性分級，掌握實驗動物隨機分組的方法和經(jīng)口灌胃的技術。觀察丙烯腈急性中毒癥狀；為后續(xù)試驗提供依據(jù)；為毒理學機制研究提供線索。,器材與試劑,1、實驗動物 ICR小鼠（健康成年小鼠）2、實驗器材 灌胃針、注射器、吸管、容量瓶、燒杯、滴管、電子天平、動物體重秤、外科剪刀、鑷子 3、實驗試劑 丙烯腈、苦味酸酒精飽和液、伊紅染液,

3、實驗方法,1、實驗動物的選擇2、劑量設計及隨機化分組3、受試物的配制4、染毒途徑的選擇5、毒性反應的觀察與LD50的計算6、急性毒性的評價,1、物種和品系 對外源化學物毒性反應與人近似易于飼養(yǎng)管理 方便實驗 操作易于獲得 繁殖生育力強 數(shù)量較大能夠保障 品系純化，價格低廉。,,一、 實驗動物選擇,2、 實驗動物的年齡與體重,動 物　　 大鼠 小鼠 豚鼠

4、 兔　 犬 貓成年年齡（周） 3 2 2 3~4 3~4 3~4 體重（克） 150 15 250 1.5kg 7~15kg 1kg壽命（年） 2~3 2~3 6~8 4~9 15~20 10~12,,,,動物數(shù)量：

5、動物6組，1-5組為實驗組，6組為蒸餾水對照組性別：雌雄各半年齡：成年動物,生理與健康狀況：未產(chǎn)未孕者、健康動物實驗動物的預檢實驗動物的給藥前禁食處理。,3、實驗動物的一般要求,健康動物標志發(fā)育正常、體態(tài)豐滿、外觀無畸形；被毛濃密、貼順有光澤、不蓬亂；胸闊寬闊、脊柱不弓不彎；眼睛明亮；表皮無潰瘍、無結痂（注意尾巴）；各天然孔干凈、無分泌物；行動靈活、反應敏捷。,實驗動物的標記,染色法 編號方法：小鼠頭部為1號

6、，順時針編號，用苦味酸編個位數(shù)，用伊紅編十位數(shù)。,,染色法,優(yōu)點： 簡單方便，不痛苦，無損傷。缺點： 時間較長時，染色劑易褪色； 標記容易模糊不清。,劑量選擇及分組,劑量選擇 廣泛查閱文獻資料，估計毒性中值預試，求出待測化學物0 %~100 %或 10 %~90 %的大致致死劑量范圍設計正式試驗的劑量和分組,預實驗：,總的原則是先用少量動物，以較大的劑量間距染毒，求出粗略的致死劑量范圍，即確定

7、受試動物全部致死的最小劑量（b）和全部不致死的最大劑量（a），即求出待測化學物0 %~100 %的大致致死劑量范圍，然后在這個劑量范圍內按幾何級數(shù)的間距設計5~7個劑量組，組間劑量呈等比級數(shù)（r），其比值為1.2~1.5。進行正式實驗。,通過預試，找出受試化學物引起動物死亡的大致劑量范圍，以此為依據(jù)設計正式試驗的劑量和分組。按下式設計劑量組：,式中：r—相鄰兩組劑量的比值，一般為1.2～1.5，b—最低全致死劑量量，a—最高不致死

8、劑量，n—設計的組數(shù)。分組恰當與否也是確保實驗結果準確的條件之一。因為組數(shù)過多，需要消耗較多的動物，還可能出現(xiàn)較大劑量組動物死亡率低于較小劑量組；組數(shù)過少，不能較精確求出LD50。,根據(jù)公比(r)計算各組劑量各組劑量分別為 第一組：a 第二組：a r 第三組：a r2 第四組：a r3 第五組：a r4 第六組：a r5,隨機化分組,將實驗動物編號，從隨機數(shù)字表上任意橫行或縱行

9、的任意數(shù)字開始，順序取下數(shù)字，標于每個動物號下，然后用計劃組數(shù)去除隨機數(shù)字，所得余數(shù)即為所屬組別。,以20只動物的完全隨機分配為例,完全隨機分配后各組所屬動物號,20只動物完全隨機分配的結果,受試物的配制方法,（1）受試化學物的量?。汗腆w受試物用稱量法，液體受試物用稱量法或吸量法。稱量法：取一定量的受試物放入已知重量的容器內，稱重，定容，計算濃度mg/ml，備用。吸量法：依設計劑量計算出應吸取液態(tài)受試物的容積，加入容量瓶中，用溶劑

10、加至刻度。,吸量法，計算公式為：X＝式中： X——應吸取受試物的容積； A——設計要求的受試物濃度（ mg/ml ）； V——容量瓶容積（ml）； d——受試化學物比重；,受試物的配制方法,（2）受試化學物的稀釋等濃度稀釋法：等容量稀釋法：,等濃度稀釋法,將受試物配制成一種濃度，不同劑量組實驗動物單位體重所給受試物的體積不同，劑量越高，所用的體積越大；劑量越低，所用的體積越小。比如某受試物的試驗劑

11、量分別為100、200、400和800mg/kg，受試物配制成10 mg/ml，每組動物每10g體重分別給與0.1、0.2、0.4和0.8 ml。,等容量稀釋法,將受試物配制成不同濃度，不同劑量組實驗動物單位體重所給受試物的體積相同，劑量越大，受試化學物配制的濃度越高。上例中，若實驗動物按0.2ml/10g b.w容量灌胃,則應配制成4個不同濃度,即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和40mg/ml。,染毒途徑的選擇,經(jīng)消化道

12、染毒：經(jīng)口灌胃法 采用專用小鼠灌胃針。 左手抓住動物雙耳后至背部的皮膚，將動物固定成垂直體位，腹部面向操作。 右手持注射器，將針頭由動物口腔側插入，避牙齒，沿咽后壁緩緩滑人食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動探索，一旦感覺阻力消失，即深人至胃部。 如遇動物掙扎，應停止進針或將針拔出，千萬不能強行插入，以免穿破食，甚至誤入氣管，導致動物 立即死亡。,

13、觀察指標,中毒癥狀：確定靶器官 ① 行動：不安定、多動、發(fā)聲； ② 神經(jīng)系統(tǒng)反應：舉尾、振顫、痙攣、運動失調、姿態(tài)異常； ③ 自主神經(jīng)系統(tǒng)反應：眼球突出、流涎、流淚、排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸。死亡和死亡時間 病理學檢查及其他指標,LD50的計算（改良寇氏法）,當急性毒性試驗的最大劑量死亡率為100%，最小劑量的死亡率為0%；各組動物數(shù)相等；各劑量組的組距等比或劑量對數(shù)等差時，用下述基本公式計算LD50：,

14、,當不含0%和100%死亡率時，用下式計算LD50：,,Xm—最大劑量對數(shù)P—各劑量組死亡率Pm—最高死亡率q—各組劑量存活率，q=1-p,以上各式中：i—組距，即相鄰兩組劑量對數(shù)劑量之差,Pn—最低死亡率∑p—各劑量組死亡率之和n—各組動物數(shù),LD50的局限性,消耗動物量大獲得的信息有限動物死亡和觀察的癥狀不足以反應生理學、血液學和其它化驗檢查所提供的毒性信息有許多因素影響LD50值的測定，實際上測得的LD50是近似值