沙打旺黃矮根腐病菌分子生物學(xué)研究.pdf

1、沙打旺（Astragalus adsurgens）是我國特有豆科牧草，適宜于干旱、半干旱和半荒漠地區(qū)，具有治理水土流失等生態(tài)作用。沙打旺黃矮根腐病是由沙打旺埃里磚格孢（Embellisia astragali）引致的沙打旺上最重要的病害之一，為系統(tǒng)性病害、氣傳病害和種傳病害。此前研究表明該病菌的形態(tài)特征及在寄主體內(nèi)的生活特性與瘋草內(nèi)生真菌(Alternaria spp.=Undifilum spp.。Embellisa spp.)相似，

2、但由于尚未見其分子生物學(xué)方面的報道，故二者相似的論斷尚缺少分子生物學(xué)的佐證。為減少種子傳播途徑和分子育種，減少病害的發(fā)生，有必要研制出種帶該病菌的快速檢測技術(shù)，以及挖掘出其致病基因。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴基于3-磷酸甘油醛脫氫酶（GPD）、RNA聚合酶II第二大亞基（RPB2）和轉(zhuǎn)錄延伸因子1-α（TEF-1）的聯(lián)合多基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該病菌與鏈格孢屬波浪芽管孢組 Genus Alternaria Section U

3、ndifilum的模式種 A. bornmuelleri DAOM231361均屬于同一組；基于核糖體編碼基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和GPD多基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示該病菌與6種瘋草中的4種瘋草內(nèi)生真菌不同，屬另一物種，兩個系統(tǒng)樹中上述兩個分支的MP自展支持率和貝葉斯后檢支持率都分別為100％和1.00；再加上此菌也具有鏈格孢屬波浪芽管孢組典型形態(tài)特征“波浪芽管”，鑒于種加詞“astragali”已被其他真菌占用。故將其更名為甘肅鏈格

4、孢Alternaria gansuense comb. nov.，厘清了沙打旺黃矮根腐病菌與瘋草內(nèi)生真菌之間的關(guān)系。⑵根據(jù)細(xì)胞質(zhì)膜三磷酸腺苷水解酶基因片段（ATPase）設(shè)計出此菌的特異性檢測引物AatpF(GTCGAGAGTTTTTTCTT)和AatpR(GGTGGAGCTGGGTTGTTTTA)，利用此特異引物進(jìn)行普通PCR，可檢測出沙打旺種子中5 pg/μL以上的此病菌DNA，帶菌率1.5%的種子；熒光定量PCR擬合方程為Ct=-

5、3.226×(log[DNA])+29.055，相關(guān)系數(shù)為0.9987，最低可以檢測0.5 pg/μL沙打旺黃矮根腐病菌DNA。運(yùn)用本方法可以準(zhǔn)確快速檢驗檢疫沙打旺種帶黃矮根腐病菌，預(yù)防該病在新建植人工栽培沙打旺草地致病成災(zāi)。⑶根據(jù)線粒體內(nèi)核糖體小亞基編碼基因（mtSSU）基因設(shè)計出瘋草內(nèi)生真菌特異性檢測引物OmtssuF（CATAGAAAAAAAAATAAACAAACTG）和OmtssuR (TGTCTGCCCAGGTTACGG)，利

6、用此特異引物進(jìn)行普通 PCR檢測，最低檢測瘋草樣品中含5 pg/μL內(nèi)生真菌DNA，熒光定量 PCR擬合方程為 Ct=-2.9105*(log[DNA])+31.213，相關(guān)系數(shù)為0.9973，最低檢測限為5 fg/μL瘋草內(nèi)生真菌 DNA。該方法可以應(yīng)用于揭示瘋草中內(nèi)生真菌含量與有毒物質(zhì)苦馬豆素含量之間的關(guān)系研究中。⑷以基因組DNA為模板，采用真菌鈣調(diào)素保守區(qū)兼并引物 CAL-228F和CAL-737R擴(kuò)增得539 bp的同源片段；采

7、用 Hi-TAIL PCR分別獲得344 bp的5’側(cè)翼序列和729 bp的3’側(cè)翼序列，拼接獲得基因的1290 bp的全長 DNA序列；利用全長引物CaMF和CaMR，得到840 bp的DNA全長序列和450 bp的cDNA全長序列，DNA全長序列中有4個內(nèi)含子，均具有典型的AT-AG特征，cDNA全長序列翻譯出149氨基酸多肽，與其他真菌的鈣調(diào)素高度同源。再次采用Hi-TAIL PCR技術(shù)克隆鈣調(diào)素基因5′端992bp和3′端109

8、6 bp的側(cè)翼序列，在此基礎(chǔ)上，用Split-Marker技術(shù)，構(gòu)建了沙打旺黃矮根腐病菌鈣調(diào)素基因的敲除載體，為后續(xù)闡明其調(diào)控該菌生物學(xué)功能、致病性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。⑸將液體搖瓶培養(yǎng)15天的沙打旺黃矮根腐病菌菌絲為材料，以0.6M MgSO4為穩(wěn)滲劑，20 mg/mL Glucanex+20mg/mL Glucanase+20 mg/mL纖維素酶+0.16 UN/mL幾丁質(zhì)酶復(fù)配，30℃，120rpm水浴振蕩酶解6h，四層擦鏡紙-漏斗法過濾