實驗細胞-神經(jīng)細胞

1、神經(jīng)細胞培養(yǎng),,在神經(jīng)生理、生化和神經(jīng)藥理的研究中、神經(jīng)細胞的體外培養(yǎng)日益受到重視，因為它是研究單個神經(jīng)細胞功能和結(jié)構(gòu)的適宜方法。在體外培養(yǎng)條件下背根神經(jīng)節(jié)、頸上交感節(jié)、胚胎脊髓和不同腦區(qū) (海馬、下丘腦、大腦皮層、小腦和垂體細胞等)培養(yǎng)細胞的形態(tài)特征都不盡相同，這與它們具有不同功能有關(guān)。交感和感覺神經(jīng)元以及不同腦區(qū)神經(jīng)元的體外培養(yǎng)成功, 為我們深入研究它們的結(jié)構(gòu)和功能提供了合適的體外實驗模型。,一、神經(jīng)細胞培養(yǎng)主要優(yōu)點:,1. 分散培

2、養(yǎng)的神經(jīng)細胞在體外生長成熟后，能保持結(jié)構(gòu)和功能上的某些特點，而且長期培養(yǎng)能形成髓鞘和建立突觸聯(lián)系，這就提供了體內(nèi)生長過程在體外重現(xiàn)的機會。 2. 能在較長時間內(nèi)直接觀察活細胞的生長、分化、形態(tài)和功能變化，便于使用各種不同的技術(shù)方法如相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、同位素標記、原位雜交、免疫組化和電生理等手段進行研究。 3. 易于施行物理（如缺血、缺氧）、化學和生物因子（如神經(jīng)營養(yǎng)因子）等實

3、驗條件，觀察條件變更對神經(jīng)細胞的直接或間接作用。 4. 便于從細胞和分子水平探討某些神經(jīng)疾病的發(fā)病機制，藥物或各種因素對胚胎或新生動物神經(jīng)細胞在生長、發(fā)育和分化等各方面的影響。,,（一）神經(jīng)細胞的原代培養(yǎng)： 原代培養(yǎng)（primary culture）是指從活體上獲得細胞、組織或器官在體外條件下進行的第一次培養(yǎng)。（二）神經(jīng)細胞系培養(yǎng) 大多數(shù)細胞經(jīng)重復傳代一定數(shù)量（一般為20-80代）將停止分

4、裂，即開始進入衰老的過程。然而，也有某些細胞群可無限傳代，并表現(xiàn)出相當穩(wěn)定的表型，成為連續(xù)細胞系（continuous cell line）。 在過去的30多年中，己經(jīng)從神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中克隆出許多細胞株，如神經(jīng)母細胞瘤( neurblastoma )、神經(jīng)膠質(zhì)瘤（glioma）、嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma)等細胞株。,二、神經(jīng)細胞的培養(yǎng)類型：,原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)的類型：,,1．雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織塊培養(yǎng)；2．

5、新生大鼠、新生小鼠及雞胚背根神經(jīng)節(jié)分散細胞培養(yǎng)；3．新生小鼠頸上交感神經(jīng)元分散細胞培養(yǎng)；4．胚胎小鼠、大鼠、雞胚脊髓腹角運動神經(jīng)元培養(yǎng)；5．新生大鼠海馬神經(jīng)元分散培養(yǎng)； 6．新生大鼠隔神經(jīng)元分散培養(yǎng)； 7．新生大鼠下丘腦神經(jīng)元分散培養(yǎng)；8．新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元分散培養(yǎng)；9．新生大鼠紋狀體神經(jīng)元培養(yǎng)；10．新生大鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)；11．新生大鼠小腦神經(jīng)神經(jīng)元培養(yǎng)；12．新生大鼠腦腺垂體細胞培養(yǎng)；13．神經(jīng)膠

6、質(zhì)細胞培養(yǎng)；14．成年大鼠背根節(jié)神經(jīng)元分散培養(yǎng)；15．海馬腦片培養(yǎng)；16．新生大鼠海馬神經(jīng)干細胞培養(yǎng)。,（一）神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng),,1．雪旺細胞： 雪旺細胞是外周神經(jīng)系統(tǒng)最主要的膠質(zhì)細胞，也是外周神經(jīng)的成髓鞘細胞；它形成髓鞘，或包裹軸突而不形成髓鞘。雪旺細胞的功能極其活躍，一旦神經(jīng)受損，它能分裂增殖，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，產(chǎn)生細胞外基質(zhì)和細胞粘附分子，對神經(jīng)元及其軸突起營養(yǎng)和修復作用。近年來的研究表明，雪旺細胞也能促進中

7、樞神經(jīng)對脫髓鞘損傷的修復，如對脊髓的再生，對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)以及對隔-海馬通路再生等。說明雪旺細胞能改善中樞神經(jīng)再生的微環(huán)境，因而近年來對雪旺細胞的研究，尤其是體外培養(yǎng)研究已成熱點。,材料和方法,,雪旺細胞培養(yǎng)材料：各類哺乳動物的外周神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)，孵化8-12d雞胚、出生1-3d 的小鼠或大鼠和人工流產(chǎn)的人胎兒。 無菌用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)，剝除神經(jīng)節(jié)被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)后用培養(yǎng)液（90%D

8、MEM，10%胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細胞懸液，先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育30min后，翻轉(zhuǎn)瓶子吸出細胞懸液，除去已貼壁的成纖維細胞，再接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中, 種植密度為0.2×105 個細胞/ml，每皿2ml細胞懸液。 36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種第3 d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml，以進一

9、步去除成纖維細胞, 作用48小時后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。,雪旺細胞的生長和形態(tài)特征,,培養(yǎng)15d后可獲得較高純度的雪旺細胞，雪旺細胞呈雙極梭狀，核卵居中，相互平行排列，經(jīng)S-100免疫組織化學染色呈陽性反應。增殖分裂的雪旺細胞可用于進一步傳代培養(yǎng)，也可進行冷凍保存?zhèn)溆谩?2．星形膠質(zhì)細胞,,星形膠質(zhì)細胞是膠質(zhì)細胞中體積最大，數(shù)量最多的一種，胞體呈星形，核大，呈卵圓形，染色質(zhì)稀少。

10、 星形膠質(zhì)細胞分兩類： 原漿性星形膠質(zhì)細胞： 突起短粗，分枝多。 纖維性星形膠質(zhì)細胞：突起細長，分枝少。與少突膠質(zhì)細胞源自同一前體細胞。,,,星形膠質(zhì)細胞具有多種功能： ● 充填空隙，起結(jié)構(gòu)的支持作用 ● 突起構(gòu)成血腦屏障 ● 攝取和代謝某些神經(jīng)遞質(zhì)如γ-氨基丁酸等 ● 調(diào)節(jié)局部神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能平穩(wěn)地發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)K+的水平而影響神經(jīng)元的電生理活動；

11、 ● 能合成和分泌大量神經(jīng)營養(yǎng)因子，有維持神經(jīng)元生存和促進神經(jīng)元突起生長的作用，亦能分泌IL、TNF、和干擾素等多種細胞因子； ● 有分裂能力，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，星形膠質(zhì)細胞增生、肥大，填補缺損，形成膠質(zhì)瘢痕。,方法和結(jié)果：,,選擇出生 2 d 的SD大鼠，無菌條件下分離出大腦皮層，用0.125%胰蛋白酶消化 (37℃ 30min) 后用培養(yǎng)液（ 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細

12、胞懸液，先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育30 min后，翻轉(zhuǎn)瓶子吸出細胞懸液，除去已貼壁的成纖維細胞，再接種于涂有鼠尾膠的75cm2塑料培養(yǎng)瓶中, 種植密度為1×105 個細胞/cm2，每瓶10ml細胞懸液置。置36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2 次，培養(yǎng)10-14h，細胞分為兩層，下一層為I型膠質(zhì)細胞即原漿形膠質(zhì)細胞，上一層是O-2A前體細胞，根據(jù)兩類細胞貼壁能力的差異，以振蕩培養(yǎng)技術(shù)進行分選，在37℃搖床上振

13、蕩，16 h（180r/min）O-2A前體細胞可被搖下來，搖下來的細胞種植在涂有鼠尾膠的75mcm2塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液使用20 % 胎牛血清促進O-2A前體細胞分化為II型膠質(zhì)細胞即纖維型膠質(zhì)細胞?？煞至言鲋车脑瓭{形膠質(zhì)細胞和纖維型膠質(zhì)細胞可用于進一步傳代培養(yǎng)，也可進行冷凍保存?zhèn)溆谩?,,純度鑒定可用膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體 （GFAP）染色確定。,（二）成年大鼠背根節(jié)神經(jīng)元培養(yǎng),,● 材料和方法 取3-6 月齡的S

14、D雄性大鼠。 無菌剪取一段脊髓，背側(cè)朝上于滅菌毛玻璃片上，在解剖顯微鏡下沿椎管兩側(cè)水平剪除腹側(cè)一半椎骨，暴露脊髓和神經(jīng)節(jié)， 取出神經(jīng)節(jié)。 置于含 1% 膠元酶(Collagenase)和1% 消化酶(Dispase)的2ml混合消化液中消化(37℃， 1 h)。 分散后用種植(Plating)培養(yǎng)液稀釋成0.2×105個細胞/ml密度的細胞懸液；接種于涂有小牛皮膠或以小鼠腦皮層膠

15、質(zhì)細胞為背景的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿置2ml細胞懸液。 標本于36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液，改用飼養(yǎng)(Feeding)培養(yǎng)液培養(yǎng)。 接種第3天, 在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml, 作用48小時后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液，以后每周換液兩次，每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。,成年大鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征,,成年大

16、鼠背根節(jié)神經(jīng)元在含 NGF 的培養(yǎng)液中種植后4h, 細胞即開始貼附在膠元薄膜層上生長，背根節(jié)神經(jīng)元的胞體一般為圓形，有時亦可見橢圓或梭形，體積較大, 直徑約8-14μm左右，胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈，神經(jīng)元的細胞核大多偏于胞體一側(cè)，核仁明顯。接種后24h，部分貼壁存活神經(jīng)元開始長出突起。培養(yǎng)2-3天后，神經(jīng)元突起逐漸增多并延長, 形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時間的延長，神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密。神經(jīng)細胞的主干和分枝明顯延長并增粗，神經(jīng)元的胞體逐

17、漸增大。成年大鼠背根節(jié)神經(jīng)元可維持培養(yǎng)2周。,（三）海馬腦片培養(yǎng),,材料和方法,,出生4-7d的Wistar大鼠 無菌取腦、分離出雙側(cè)海馬，用雙面刀片垂直于海馬長軸將其切成厚約400μm左右的腦薄片，接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿按切片順序按Z字形接種10個腦片, 置腦片于36℃濕盒內(nèi)孵育2h，使腦片較牢固地貼附在膠原上，然后加入1.5ml飼養(yǎng)培養(yǎng)液，在36℃、含10%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

18、 接種第5 d，在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5 -氟- 2-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或加入阿糖胞苷 3μg/ml以抑制非神經(jīng)細胞的過度增殖, 作用48h 后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液2次，每次更換50%新鮮培養(yǎng)液。,海馬腦片培養(yǎng)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征,,海馬腦片種植后 24h，可見少數(shù)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞開紿從海馬腦片的不同區(qū)域向外纖移生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，可見不同腦區(qū)越來越多的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞向外纖

19、移生長，并形成密集的網(wǎng)絡(luò)。當加入細胞分裂抑制劑抑制膠質(zhì)細胞增殖后，可以獲得較純的不同腦區(qū)的培養(yǎng)神經(jīng)元。,（四）新生大鼠海馬神經(jīng)干細胞培養(yǎng),,干細胞是指在一定時期具有自我更新能力和廣泛發(fā)育潛能的細胞，神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)是近年來神經(jīng)科學領(lǐng)域研究的重大突破，神經(jīng)干細胞的研究成了近期研究的熱點，不僅因為其具有研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要性，更主要的是其潛在的治療價值；神經(jīng)干細胞研究的主要難點是不能在體內(nèi)將它們與其它細胞分開，故通常采用在體外培養(yǎng)一段時間

20、后形成細胞克隆，分離出神經(jīng)干細胞。體外培養(yǎng)可增殖，獲得大量神經(jīng)干細胞，這些細胞若能被誘導分化為某種特異神經(jīng)元，用以代替損傷神經(jīng)元，這將為神經(jīng)再生和功能重建提供充足而理想的移植材料。,材料和方法,,取當天出生的Wistar大鼠，在無菌條件下分離出雙側(cè)海馬，用0.125%胰蛋白酶消化(36℃、30min)分散后，用培養(yǎng)液（98% DMEM或F12， 1% 神經(jīng)營養(yǎng)素，1% 谷氨酰胺，BFGF 20μg/L，EGF 20μg/L）吹打分散制成

21、細胞懸液，接種于75cm2塑料培養(yǎng)瓶中， 種植密度為1×105 個細胞/cm2，每瓶10ml細胞懸液。置36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代克隆形成后再次機械分離克隆制作單細胞懸液，接種于75cm2塑料培養(yǎng)瓶中。此后每周機械分離克隆傳代1次，方法同前。,新生大鼠海馬神經(jīng)干細胞的生長和形態(tài)特征,,新生大鼠海馬細胞在上述無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) 2d后，大部細胞死亡，部分細胞分裂形成，2-4個細胞的細胞團，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞團逐

22、漸增大，細胞團數(shù)目逐漸多?？捎糜谶M一步傳代培養(yǎng)也可進行冷凍保存?zhèn)溆谩?純度鑒定可用Nestin染色確定。,,NSE,GFAP,海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)10天 免疫組化鑒定,（五） 海馬神經(jīng)元的無血清培養(yǎng),,無血清神經(jīng)細胞培養(yǎng)研究越來越受到科學家們重視，主要原因： （1）在進行神經(jīng)細胞營養(yǎng)研究時，由于血清成份復雜且不穩(wěn)定，妨礙對神經(jīng)細胞營養(yǎng)要求的確切了解。 （2）在進行激素和藥物研究時，血清成份與激素或

23、藥物結(jié)合的結(jié)果，干擾了其對神經(jīng)細胞的作用。 （3）干擾對培養(yǎng)神經(jīng)細胞釋放產(chǎn)物的分析。 （4）血清只能過濾消毒，過濾消毒只能除去細菌，但不能除去血清中可能含有的病毒和支原體。 因此，人們期望用不含血清的的培養(yǎng)液培養(yǎng)神經(jīng)細胞?，F(xiàn)將兩種無血清培養(yǎng)海馬神經(jīng)細胞的方法介紹如下：,材料與方法：,,取當天出生的Wistar大鼠，在無菌條件下分離出雙側(cè)海馬。用0.125%胰蛋白酶消化(36℃、30min)分散后，

24、用種植培養(yǎng)液(79% DMEM/F12，10%馬血清，10% 胎牛血清，1%谷氨酰胺)，稀釋成5×106個細胞/ml密度的細胞液， 接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿2ml，置標本于36℃、含10%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后頃去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液，改用無血清飼養(yǎng)培養(yǎng)液(98% DMEM/F12， 1% 神經(jīng)營養(yǎng)素，1% 谷氨酰胺)培養(yǎng)。接種第10 d，在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟- 2-脫氧尿苷15μ

25、g/ml和尿苷35μg/ml或加入阿糖胞苷 3μg/ml以抑制非神經(jīng)細胞的增殖，作用48h 后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液2次，每次更換50%新鮮無血清培養(yǎng)液。,,2．新生大鼠海馬神經(jīng)元無血清培養(yǎng)時 的生長分化和形態(tài)特征,新生大鼠海馬神經(jīng)元種植后12h，大部分細胞可貼壁，呈圓形，其中少數(shù)神經(jīng)細胞開始伸出1-2個突起。培養(yǎng)24h后，伸出突起的神經(jīng)細胞逐漸增多, 突起一般為20-40μm，長者可達60μm。改用無血清飼養(yǎng)培養(yǎng)液培

26、養(yǎng)3d后, 神經(jīng)元突起進一步增多并延長，形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)的海馬細胞以錐體細胞為多見，胞體較大，直徑6-12μm。隨著培養(yǎng)時間的延長，神經(jīng)元胞體逐漸增大，胞突主干和分技明顯延長并增粗，形成更加稠密的網(wǎng)絡(luò)。海馬神經(jīng)元在體外可維持無血清培養(yǎng) 1個月。,,,三、神經(jīng)細胞培養(yǎng)的注意事項,1 NGF是必不可少的營養(yǎng)因子,,在背根節(jié)神經(jīng)細胞培養(yǎng)過程中，早期感覺神經(jīng)元發(fā)育階段，NGF是必不可少的營養(yǎng)因子，但在培養(yǎng)后期，神經(jīng)元已發(fā)育成熟，可能非神

27、經(jīng)細胞分泌的極少量NGF即能滿足神經(jīng)元生長需要，因此不另加NGF也能維持長期培養(yǎng)。 在上頸交感節(jié)細胞分散培養(yǎng)過程中，若最初1-2d在培養(yǎng)液中缺乏 NGF，交感神經(jīng)元突起不見生長，且大多死亡。培養(yǎng)15d或1個月時，如果培養(yǎng)液中未加入NGF，本來生長良好的神經(jīng)元很快便出現(xiàn)顆粒變性或空泡， 逐漸死亡。表明NGF對于促進神經(jīng)突起生長和維持神經(jīng)元生存有顯著作用。,2 細胞接種密度,,在神經(jīng)細胞培養(yǎng)過程中，神經(jīng)細胞的生長發(fā)育受到多

28、種因素的影響，其中細胞接種密度對細胞生長發(fā)育影響較大，一般神經(jīng)細胞的接種密度以0.5-1×106 個細胞/ml密度為宜，如每毫升中超過3×106個細胞/ml密度，將使細胞簇過大，而且培養(yǎng)皿內(nèi)過分擁擠， 影響存活和生長。但如果培養(yǎng)的細胞數(shù)目過少時，神經(jīng)細胞的生長分化較差，因為神經(jīng)細胞是一種細胞群體, 它們相互之間具有營養(yǎng)和支持作用。其次是控制非神經(jīng)元細胞過多增殖。,3 抗DNA 藥物加入培養(yǎng)液 抑制膠質(zhì)細胞過渡增殖,

29、,原代分散單層培養(yǎng)是神經(jīng)細胞與非神經(jīng)細胞的混合培養(yǎng)。其中膠質(zhì)細胞等可在體外繼續(xù)增殖，神經(jīng)元則不能增殖而只能生長分化。適量膠質(zhì)細胞的存在是神經(jīng)細胞長期培養(yǎng)的必要條件， 如果神經(jīng)膠質(zhì)細胞過渡增殖時，神經(jīng)細胞的生長分化便受到一定影響，常使神經(jīng)細胞提早開始退化。,,,由于神經(jīng)膠質(zhì)細胞頻繁分裂過程中， 奪取了神經(jīng)細胞生長中需要的某種營養(yǎng)成份。為保證神經(jīng)元生長所需的營養(yǎng)， 需在非神經(jīng)細胞增殖的高峰即所謂“合流” 時，將一定量的抗DNA 藥物加入培養(yǎng)

30、液中以抑制其過渡增殖，實驗證明，在培養(yǎng)第5d 或第7d時用 5-氟-2-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或阿糖胞苷3μg/ml，作用48h即停用可加快神經(jīng)元的分化， 延長培養(yǎng)時間。,4 培養(yǎng)液必須保持一定的等滲性,,所配制的培養(yǎng)液必須保持一定的等滲性，溶解于培養(yǎng)基的物質(zhì)濃度所產(chǎn)生的等滲性必須與細胞外液的液體一致，培養(yǎng)神經(jīng)細胞可將培養(yǎng)液的滲透壓調(diào)節(jié)到320-330 mOso 較為合適。如果培養(yǎng)液是高滲的，細胞會失去水份并發(fā)生皺縮

31、，如果培養(yǎng)液是低滲的，細胞會吸收水分而膨脹。兩者不利于神經(jīng)細胞的存活和生長。,5 掌握換液的次數(shù)和數(shù)量,,為了使神經(jīng)細胞得到生長分化必須的營養(yǎng)，必須經(jīng)常進行換液，但如果換液次數(shù)太多，并不利于神經(jīng)細胞的生長分化，因為神經(jīng)細胞在培養(yǎng)液中需要適當?shù)沫h(huán)境，而且它本身也有創(chuàng)造良好環(huán)境的能力，如果頻繁換液就會破環(huán)這種環(huán)境。一般每周換液二次，每次只換一半，保留一半原液。除此之外，培養(yǎng)液的PH、溫度等均對神經(jīng)元的生長發(fā)育有影響，因而在實驗中必須加以注意