醫(yī)學(xué)領(lǐng)域生物化學(xué)與分子生物學(xué)科研方法與評價_第1頁
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文檔簡介

1、Apoptosis 細(xì)胞凋亡研究方法建立與評價,蔣紀(jì)愷,研究生?,研究方向研究立題(研究背景、發(fā)現(xiàn)問題、提出問題(?)、提出假設(shè)、解決問題的策略與方法) 申請課題,獲得經(jīng)費(fèi)實驗驗證(實驗?zāi)P?、技術(shù)指標(biāo)、方法建立與評價)結(jié)果分析(撰寫論文,申報專利,評獎),,研究方向:白血病研究立題:腫瘤靶向治療的分子機(jī)制研究。文獻(xiàn) 閱讀與學(xué)習(xí)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在白血病發(fā)

2、生 與治療的背景知識 研究模型:白血病細(xì)胞株;動物模型等技術(shù)平臺:實驗技術(shù)的建立與評價,(技術(shù)指 標(biāo),動手能力) 結(jié)果分析:統(tǒng)計學(xué)知識,文獻(xiàn)回顧論文撰寫:語言能力,研究背景,腫瘤治療手術(shù)放療化療骨髓移植(白血病),增殖 分化 凋亡

3、 Survival Growth Differetiation Apoptosis 腫瘤 Tumour,,,,,,立題依據(jù),增殖:細(xì)胞通過分裂使細(xì)胞數(shù)目增加的過程 ,細(xì)胞分裂。(真核細(xì)胞的增殖方式有:有絲分裂、減數(shù)分裂、無絲分裂三種方式,只有連續(xù)進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞才具有細(xì)胞周期。 )分化:在個體發(fā)育中,通過細(xì)胞分裂后產(chǎn)生的子代細(xì)胞比上一代細(xì)胞具有更專一的功能。

4、后代在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生穩(wěn)定性的差異過程稱為細(xì)胞分化(cellular differentiation)。(比如血液中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板等都是從造血干細(xì)胞分化出來的,但是與造血干細(xì)胞相比,這些子代細(xì)胞都具有更加專一的功能。 )凋亡:細(xì)胞凋亡指的細(xì)胞的程序性死亡,細(xì)胞被自身的酶降解,按一定的步驟“自殺”,其死亡細(xì)胞仍為一整體,最終被白細(xì)胞吞噬。(而細(xì)胞壞死會有細(xì)胞壁破裂的現(xiàn)象,內(nèi)含物外泄,會影響周圍的細(xì)胞。),,,,

5、啟動 凋亡早期 凋亡中期 凋亡晚期,Caspase 激活,★核染色質(zhì)凝縮★ 細(xì)胞膜PS 外翻★線粒體膜電位喪失★DNA 被切割成片段,凋亡小體形成,信號通路,,研究模型,慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML ) 逆轉(zhuǎn)K562 cell line 分化(紅系細(xì)胞) 增殖

6、 凋亡 藥物誘導(dǎo),,,,,Leukemia cell lines,K562 cellsa bcr:abl positive erythroleukamia line derived from a 53 year old female CML patient in blast crisisPhiladelphia

7、 chromosome,,Leukemia cell lines,HL60(Human promyelocytic leukemia cells)derived from a 36-year-old woman with acute promyelocytic leukemia at the National Cancer Institute,,研究方法建立與評價,靈敏度特異性蛋白質(zhì)分析1,染色2,酶3,免疫分泌蛋白、膜

8、蛋白、細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核蛋白,方法學(xué)建立與研究策略,藥物濃度的選擇(MTT)形態(tài)學(xué)觀察(凋亡小體形成)DNA 被切割成片段細(xì)胞膜PS 外翻Caspase 激活信號通路,MTT測定細(xì)胞增殖,MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法)是Mosmann1983年報告的。原理是活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶能將四氮唑化物(MTT)由黃色還原為紫紅(蘭)色的甲(肷)紫,后者溶于有機(jī)溶劑(如二甲基亞楓、酸化異丙醇等),甲紫(肷)產(chǎn)量與細(xì)胞活性成正

9、比??稍?60nm處用酶標(biāo)儀測定其OD值。,形態(tài)學(xué)觀察,DNA 被切割成片段,Annexin V,基本原理細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面,目前早期識別仍有困難。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外,使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂,正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面,在細(xì)胞發(fā)生凋亡時細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋

10、白,最初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此,該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的,也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的,而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此,可以建立一種用Annexin V結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗以檢測

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