分子生物學的研究方法-dna-蛋白質相互作用

1、第六節(jié) 研究DNA與蛋白質相互作用的方法,又叫做DNA遷移率變動試驗，是80年代初出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。簡單、快捷，是當前被選作分離純化特定DNA結合蛋白質的一種典型的實驗方法。在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離是同其分子量的對數成反比，如果DNA分子結合上一種蛋白質，那么由于分子量加大，在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，朝正電極移動的距離也就相在縮短了。所以當特

2、定的DNA片段同細胞提取物混合之后，若其在凝膠電泳中的移動距離變小了，這就說明它已同提取物中的某種特殊蛋白質分子發(fā)生了結合作用。,2.6.1 凝膠阻滯試驗原理,返回目錄,返回第二章,凝膠阻滯試驗方法,首先是用放射性同位素標記待檢測的DNA片段（亦稱探針DNA），然后同細胞蛋白質提取物一道溫育，于是便有可能形成DNA一蛋白質復合物。將它加樣到非變性的凝膠中，在控制使蛋白質仍與DNA保持結合狀態(tài)的條件下進行電泳分離，并應用放射自顯影技術顯

3、現(xiàn)具放射性標記的DNA條帶位置。如果細胞層白質提取物中不存在可同放射性標記的探針DNA結合的蛋白質，那么所有放射性標己都將集中出現(xiàn)在凝膠的底部；反之，將會形成DNA一蛋白質復合物，由于凝膠阻滯的緣故，其特有的放射性標記的探針DNA條帶就將滯后出現(xiàn)在較靠近凝膠頂部的位置。所以有的文獻中也稱這種試驗為條帶阻滯試驗（band retardation assay）。,,凝膠阻滯試驗用途,鑒定特殊細胞提取物中，是否存在可同放射性標記的探針DNA結

4、合的蛋白質分子（比如特異的轉錄因子等）研究發(fā)生此種結合作用之精確的DNA序列的特異性：其辦法是在DNA一蛋白質結合反應體系中，加入超量的非標記競爭DNA。如果競爭同一種蛋白，由于競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的，絕大部分蛋白質都會被其競爭結合掉而使探針DNA處于自由狀態(tài)，自顯影圖片上不出現(xiàn)阻滯的條帶，相反，如果不競爭同一蛋白，探針DNA仍與特定蛋白復合，呈現(xiàn)阻滯的條帶。使用競爭DNA，可間接闡明體內的DNA與蛋白質的相互作用。

5、如，使用一種具有與已知轉錄因子結合位點的競爭DNA，就可以判斷檢測到的蛋白質是否屬于此類轉錄因子，或是與之相關的其它轉錄因子；如果事先引入突變，可以檢測突變對其與轉錄因子結合作用的影響。,2.6.2 DNasel足跡試驗,盡管凝膠阻滯試驗能夠揭示出在體內發(fā)生的DNA蛋白質之間相互作用的有關信息，然而它卻無法確定兩者結合的準確部位。要解答這個問題，則需要應用 DNasel足跡試驗（footprinting assay）。它是一類用于檢測與

6、特定蛋白質結合的DNA序列的部位及特性的專門的實驗技術。,DNasel足跡試驗過程,首先是將待檢測的雙鏈DNA分子用32P作末端標記，并用限制酶去掉其中的一個末端，得到只一條鏈單末端標記的雙鏈DNA分子體外同細胞蛋白質提取物混合。待二者結合之后，再加入少量的 DNasel（它可沿著靶 DNA作隨機單鏈切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之達到平均每條鏈只發(fā)生一次磷酸二脂鍵的斷裂。如果蛋白質提取物中不存在與DNA結合的特異蛋白質，經D

7、Nasel消化之后便會產生出距放射性標記末端1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸等一系列前后長度均僅相差一個核苷酸的、不間斷的、連續(xù)的DNA片段梯度群體。,從此混合物中除去蛋白質之后，將DNA片段群體加樣在變性的DNA測序凝膠中進行電泳分離，經放射自顯影，便可顯現(xiàn)出相應于DNasel切割產生的不同長度DNA片段組成的序列梯度條帶。但是，如果有一種蛋白質已經結合到DNA分子的某一特定區(qū)段上，那么它就將保護這一區(qū)段的DNA免受DNasel的消

8、化作用，因而也就不可能產生出相應長度的切割條帶。所以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應于蛋白質結合的部位是沒有放射標記條帶的，出現(xiàn)了一個空白的區(qū)域，人們形象地稱之為“足跡” 。,足跡試驗的優(yōu)點,可以形象地展示出一種特殊的蛋白質因子同特定DNA片段之間的結合區(qū)域。如果使用較大的DNA片段，通過足跡試驗便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質因子之間的結合位點的分布狀況。如同凝膠阻滯試驗一樣，也可以加入非標記競爭DNA，來消除特定的足跡，據

9、此確定其核酸序列的特異性。,DNasel足跡試驗發(fā)展,目前還出了若干種其它類型的足跡試驗。例如，自由羥基足跡試驗及菲咯琳銅足跡試驗等。其中最有趣的是硫酸二甲脂（DMS）足跡試驗。它所依據的原理是，DMS能夠促進DNA中裸露的G甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異的化學切割。假如有一種蛋白質同DNA分子中的某一區(qū)段結合，在它的保護下，區(qū)域內的G免受六氫吡啶的切割，于是在DNA片段的序列梯中，便不存在具這些G殘基末端的DNA片段，故

10、出現(xiàn)個空白區(qū)域，此即通常所說的足跡。 與其它足跡試驗不同，由于DMS足跡試驗中被切割的是G殘基，因此可用來鑒定同轉錄因子蛋白質結合的DNA區(qū)段中的特異堿基。,2.6.3 甲基化干擾試驗,應用甲基化干擾試驗（methvlation interference assay）技術，可以檢測靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對爾后的蛋白質結合作用究竟會有什么效應，從而更加詳細地揭示DNA與蛋白質之間相互作用的模式。,甲基化干擾試驗的具體操作

11、,先用硫酸二甲脂（DMS）處理靶DNA，控制反應條件，使平均每條DNA分子只有一個G甲基化，而后將這些局部甲基化的DNA群體同含有DNA結合蛋白的適當的細胞提取物一道溫育，并作凝膠阻滯試驗。經電泳分離之后，從凝膠中切取出具有結合蛋白質的DNA條帶和沒有結合蛋白質的DNA條帶，并用六氫吡啶處理之，于是甲基化的G殘基被切割，非甲基化的G殘基則不被切割。顯而易見，如果某個G因甲基化而不與蛋白質結合，那么六氫吡啶對這個甲基化G殘基的切割作用，就

12、只能在沒有同蛋白質結合的DNA分子上表現(xiàn)出來。相反地，如果一個特殊的G殘基在DNA與蛋白質的結合中不起作用，那么六氫吡啶對這個G殘基的切割作用，則在同蛋白質結合的DNA分子及不同蛋白質結合的DNA分子中均可觀察到（圖2－44）,甲基化干擾試驗的用途,甲基化干擾試驗不僅可以用來研究蛋白質與G殘基之間的聯(lián)系，而且同樣也可以用來研究DNA結合蛋白質與結合位點中的腺嘌呤A殘基之間的聯(lián)系作用。頭一個辦法是使所有的嘌呤殘基甲基化，以便同時研究甲基化

13、的G和A殘基對蛋白質與DNA結合的干擾效應。第二種辦法是使用焦碳酸二乙脂（DEPC）特異性修飾A，而使之易受六氫吡啶的切割作用。對于研究諸如像具有相對少數G殘基的八聚體基序（例如 OCt－1，OCt－2等，它們可與八聚體結合蛋白質結合）這樣的序列而言，這些甲基化干擾試驗技術具有特別的價值，因為只要研究G殘基的甲基化干擾，就可獲得有用的信息。,DMS化學干擾的主要局限性,它只能使G和A殘基甲基化，而不能使T和C殘基甲基化。盡管如此，它仍不

14、愧為足跡試驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質相互作用的精確位置。,2.6.4 體內足跡試驗,上面所討論的這三種方法有一個共同的不足之處，即它們都是在體外進行的試驗。因此人們自然會問，這些結果能夠確切地反映活細胞內發(fā)生的DNA一蛋白質相互作用的真實情況嗎？為了解答這個問題，科學工作者又設計出了一種體內足跡試驗體系。然而究其實質而言，這種技術無非是體外DMS足跡試驗的一個變種而已。,體內足跡試驗的方法,用有限數量的化學

15、試劑DMS處理完整的游離細胞，并使其滲透到細胞內的濃度恰好導致天然染色質DNA中的G殘基發(fā)生甲多化。而后從這些細胞中提取DNA，并加入六氫吡啶作體外消化。結果情況就如同體外足跡試驗一樣，能同某種特殊蛋白質因子結合的DNA區(qū)段，其上的G殘基就不會被DMS甲基化，因而也就不會被六氫吡啶所切割。因此，同對照的體外裸露DNA所形成的序列梯比較，就會發(fā)現(xiàn)由完整的活細胞染色質DNA形成的序列梯中，缺少了G殘基沒有被切割的相應條帶（圖2－45）。,體

16、內足跡試驗優(yōu)缺點,顯而易見，與應用克隆DNA片段所作的體外足跡試驗的結果相比，經體內足跡試驗從染色質總DNA中所獲得的任何一種特異DNA的數量，都是微不足道的。因此，有必要通過PCR擴增特異的靶DNA，以獲得足夠數量的DNA樣品。如今體內足跡試驗已發(fā)展成為研究在完整的活細胞內，DNA一蛋白質結合位點及檢測結合位點中堿基突變效應的一種極有效的手段。,應用凝膠阻滯試驗、DNasel足跡試驗、甲基化干擾試驗，以及體內足跡試驗等多種用于研究DN

17、A與蛋白質相互作用的基本實驗手段，將有助于深入地探討基因啟動子元件的結構與功能，及其與蛋白質轉錄因子之間相互作用的有關細節(jié)；揭示mRNA轉錄超始和終止的分子本質與主要步驟；闡明在發(fā)育過程中基因表達調節(jié)的時空特異性；以及外源基因在轉基因植株中表達的分子機理，等等。這些研究結果，將為我們提供大量重要的信息，以最終弄清基因表達調節(jié)的真實內容。,思考題,1、研究DNA與蛋白質相互作用的方法有哪些？2、凝膠阻滯試驗原理是什么？3、用圖示的方法