儀器分析——陳鋒

1、現(xiàn)代生化儀器分析,電泳技術(shù),電泳的基本原理,電泳是在電場(chǎng)的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運(yùn)動(dòng)，不同的物質(zhì)在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動(dòng)速度不同進(jìn)而達(dá)到分離目的。,在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。,電泳的分類,顯微電泳等電聚焦

2、電泳等速電泳密度梯度電泳,電泳,自由電泳（無(wú)支持體）,區(qū)帶電泳（有支持體）,,,,濾紙電泳（常壓及高壓）薄層電泳（薄膜及薄板）凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化小，沒(méi)有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。,聚丙烯酰胺凝膠電泳按原

3、理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳和雙向電泳等類型。,不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳,系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：,凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。,緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

4、,在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學(xué)研究中常用的技術(shù)，可用于分離，鑒定和純化DNA或RNA片段。不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的DNA分子在相同的電泳條件下，有不同的遷移率，所以可通過(guò)電泳使其分離。,分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度,,在凝膠電泳中，一

5、般加入溴化乙錠（EB）--ethidium bromide染色，此時(shí)，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ng DNA所形成的條帶。,電泳緩沖液,,TAE：乙酸鹽緩沖液TBE：硼酸鹽緩沖液TPE：磷酸鹽緩沖液,電泳裝置,,Structure and Function Analysis of Nucleocapsid Protein of Tomato Spotted Wilt Virus Interacting with R

6、NA Using Homology Modeling,,研究背景：,對(duì)于許多病毒的蛋白來(lái)說(shuō)，很難得到它們的晶體結(jié)構(gòu)，因此這就對(duì)分析病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了困難。這些病毒中就包括番茄斑萎病毒（TSWV）,結(jié)果：,使用同源建模的方法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析論證，得出了病毒粒子的RNA與病毒核衣殼蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了TSWV的核衣殼蛋白可以保護(hù)RNA免遭RNA酶的分解這一特點(diǎn)。,結(jié)論：,同源建模為T(mén)SWV核衣殼蛋白的功能以及與RNA相互作用的分

7、析提供了基礎(chǔ)依據(jù)。,意義：,同源建模的方法也可應(yīng)用于其他植物病毒。,Abstract&Introduction：,TSWV病毒粒子的核糖核蛋白（RNP）中包裹的RNA為病毒基因的轉(zhuǎn)錄和基因組的復(fù)制提供了模板（而不是裸露的RNA），在核糖核蛋白包裹基因組RNA的過(guò)程中，TSWV的結(jié)構(gòu)蛋白核衣殼蛋白（N）發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。然而，很少有人知道該過(guò)程的分子機(jī)制，N與基因組RNA是如何相互作用的呢？在這項(xiàng)研究中，我們證實(shí)了TSWV的核

8、衣殼蛋白會(huì)形成一系列高度有序的低聚物。在對(duì)這些低聚物與基因組ＲＮＡ的結(jié)合行為的分析中，揭示了這些低聚物與ＲＮＡ的結(jié)合沒(méi)有特異性，各種類型的Ｎ低聚物都可與ＲＮＡ結(jié)合。為了更好的確定與ＲＮＡ作用的Ｎ蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，我們采用同源建模的方法，構(gòu)建了Ｎ和Ｎ－ＲＮＡ復(fù)合物的同源模型。基于對(duì)這些同源模型的分析，我們就可以預(yù)測(cè)出Ｎ蛋白的結(jié)構(gòu)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在該結(jié)構(gòu)的表面存在大量的帶正電荷的極性氨基酸殘基，并且證實(shí)這些對(duì)Ｎ蛋白與ＲＮＡ的結(jié)合是至關(guān)重要的另

9、外對(duì)得出的Ｎ－ＲＮＡ復(fù)合物模擬結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，ＲＮＡ牢牢嵌入了這個(gè)復(fù)合物中。因此，由于Ｎ－RNA復(fù)合物的形成可以使病毒的RNA抵抗RAN酶的消化,質(zhì)粒的構(gòu)建,在該實(shí)驗(yàn)中共構(gòu)建了三種質(zhì)粒。第一種是表達(dá)野生型TSWV 核衣殼蛋白（N）的質(zhì)粒。使用的質(zhì)粒載體是pET 28a，該質(zhì)粒上帶有多聚組氨酸標(biāo)簽（His6 Tag），有利于后期蛋白的分離純化。第二種是表達(dá)突變型TSWV核衣殼蛋白（N)的質(zhì)粒。表達(dá)出來(lái)的突變型N是通過(guò)定點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)的。

10、這種蛋白為后面分析RNA的結(jié)合位點(diǎn)提供材料。第三種是克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)錄的RNA用于探針的制備。使用的質(zhì)粒是pMD19，該質(zhì)粒帶有TSWV末端序列，并且?guī)в芯G色熒光蛋白標(biāo)記基因。,蛋白表達(dá)和純化,構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli（DE3）中進(jìn)行表達(dá)，將10ml 過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌轉(zhuǎn)移到1L的容器中在37攝氏度下繼續(xù)培養(yǎng)，直到600nm處的光密度值達(dá)到0.6為止。,加入0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-

11、thiogalactopyranoside IPTG）誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。需要在25度下過(guò)夜培養(yǎng)。,溶菌酶處理培養(yǎng)液，然后在冰上用超聲波破碎培養(yǎng)液中的細(xì)胞，在12800 X g的離心力下離心1小時(shí)。,取上清液，采用NI-NTA親和層析法純化蛋白,,,,檢驗(yàn)重組蛋白準(zhǔn)確表達(dá),將純化得到的重組TSWV N蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，得到下圖結(jié)果。從圖中可以得出重組蛋白的分子量大約在25kDa---35kDa之間。然后再通過(guò)蛋白免疫印跡同樣檢測(cè)到

12、了重組蛋白。因此可以確定重組蛋白得到準(zhǔn)確表達(dá)。,重組TSWV N蛋白可以與E.coli 的胞內(nèi)RNA結(jié)合,當(dāng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化的蛋白的濃度是發(fā)現(xiàn)，純化的TSWV N蛋白的OD260/OD280的值上升到了1.7，這說(shuō)明TSWV N蛋白結(jié)合了E.coli的內(nèi)源RNA。為了證明這一推論，我們將得到的純化的蛋白做變性處理，使其將結(jié)合的RNA釋放出來(lái)。同時(shí)，提取了在相同品系中表達(dá)的重組麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）作為對(duì)照。將兩種結(jié)合蛋白

13、變性處理后，加到經(jīng)過(guò)EB染色的1%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)RNA。觀察結(jié)果圖得出，在N 蛋白的區(qū)域很容易檢測(cè)到RNA，而MBP的區(qū)域沒(méi)有檢測(cè)到RNA存在。因此得出結(jié)論 ：TSWV N蛋白可以與E.coli的內(nèi)源RNA非特異的結(jié)合。,TSWV N 蛋白可以形成不同形式的低聚物,為了證實(shí)N蛋白形成低聚物，我們進(jìn)行了濃度不連續(xù)非變形的凝膠電泳（即BN-PAGE）。這種電泳使用的膠為非變性膠，可以使蛋白復(fù)合物在處于活性狀態(tài)下得到分離。將得到的

14、純化N 蛋白進(jìn)行BN-PAGE。得到下圖結(jié)果。,從左側(cè)的電泳圖中可以看出，TSWV N蛋白形成了一系列的不同類型的低聚物。有31kDa的單體，62kDa的二聚體，93kDa的三聚體，124kDa的四聚體，155kDa的五聚體。,由于做電泳使用的蛋白是用Ni-NTA純化得到的蛋白，所以這些蛋白中帶有組氨酸標(biāo)簽。為了排除低聚物的形成是由于這些標(biāo)簽引起的這一可能。我們把帶有標(biāo)簽的蛋白的N末端的組氨酸標(biāo)簽切去得到不帶有標(biāo)簽的蛋白。對(duì)這些蛋白進(jìn)行

15、相同的電泳分析，得到如下圖的結(jié)果。,觀察電泳圖發(fā)現(xiàn)形成的各類低聚物條帶與帶有標(biāo)簽蛋白的電泳條帶是一樣的。同樣形成了各種類型的低聚物。這就說(shuō)明N蛋白可以通過(guò)自身的交聯(lián)形成各種類型的低聚物。,為了更進(jìn)一步的證實(shí)以上的結(jié)論，我們?cè)诩兓牡鞍字屑尤肓私宦?lián)劑（戊二醛）。然后在5%-20%SDS-PAGE分離，并用考馬斯亮藍(lán)染色。從電泳圖中很明顯的可以發(fā)現(xiàn)，隨著交聯(lián)劑的不斷增加，各個(gè)類型低聚物的條帶的顏色不斷加深。這就又證實(shí)了以上的結(jié)論：TSWV

16、N蛋白可以形成一系列的高度有序的低聚物。,TSWV N 蛋白的低聚物與RNA的結(jié)合,從以上的實(shí)驗(yàn)中我們已經(jīng)確定N 蛋白形成了不同類型的低聚物，接下來(lái)研究這些低聚物與RNA分子的結(jié)合，與RNA的結(jié)合是否與低聚物的形成有一定的聯(lián)系。由于從E.Coli中表達(dá)出的重組N蛋白可以與E.Coli的RNA非特異結(jié)合，所以在研究N蛋白與TSWV的RNA的結(jié)合之前需要除去重組N蛋白上結(jié)合的E.Coli RNA。使用PEI（聚乙烯亞胺）處理得到的N蛋白，然

17、后分別對(duì)PEI處理的蛋白和未經(jīng)處理的蛋白進(jìn)行RNA凝膠電泳分析。得到下圖結(jié)果：,很容易從圖中觀察到在未經(jīng)處理的N蛋白中檢測(cè)到了RNA，而經(jīng)過(guò)處理的蛋白中沒(méi)有RNA。所以經(jīng)過(guò)PEI的處理重組蛋白上結(jié)合的E.Coli RNA會(huì)被沉淀過(guò)濾掉。,接下來(lái)為了確定N 蛋白結(jié)合RNA是否是形成蛋白低聚物所必須的，我們將經(jīng)過(guò)PEI處理的蛋白和未經(jīng)PEI處理的蛋白分別進(jìn)行BN-PAGE。得到了如下圖所示的電泳圖譜：,從圖中可以看出經(jīng)PEI處理和未經(jīng)處理

18、的蛋白產(chǎn)生了相似的條帶，都形成了一系列的低聚物。,結(jié)合上面的實(shí)驗(yàn)證實(shí)N蛋白低聚物的形成與是否結(jié)合有RNA無(wú)關(guān),分析N蛋白與RNA的結(jié)合作用。將一定量的PEI處理過(guò)的N蛋白與未標(biāo)記的RNA（ssRNA，帶有TSWV末端序列）混合，并逐漸增加RNA的量，然后將混合物在不連續(xù)的非變性凝膠中電泳。同樣的樣品也進(jìn)行了變性的SDS-PAGE。,ssRNA的量在1-10微克時(shí)，所形成的復(fù)合物的類型并沒(méi)有發(fā)生變化，但是當(dāng)繼續(xù)增加ssRNA的量在20-8

19、0微克時(shí)，發(fā)現(xiàn)各種類型的低聚物消失了。低聚物的消失說(shuō)明了各個(gè)類型的低聚物結(jié)合了更多的ssRNA形成了更大的復(fù)合物。分析各個(gè)樣品的SDS-PAGE結(jié)果可以說(shuō)明低聚物的消失不是由蛋白酶的降解造成的。,TSWV N蛋白可以結(jié)合E.Coli的內(nèi)源RNA，我們利用它這一特點(diǎn)來(lái)論證N蛋白形成的各個(gè)類型的低聚物都可以與RNA結(jié)合。,將從大腸桿菌中分離純化出來(lái)的N蛋白，在4%-16% 的藍(lán)色的非變性的凝膠中電泳分離,加RNA結(jié)合緩沖液（95%的甲酰胺）

20、使蛋白復(fù)合中的RNA釋放出來(lái),100度沸水浴5分鐘，在1%瓊脂糖凝膠（含有EB）中電泳，紫外光下照射觀察,膠回收，破碎膠，加PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）洗脫,,,,從瓊脂糖電泳圖譜中可以看出，在1,2,3,4區(qū)域內(nèi)均檢測(cè)到了RNA，所以可以得出結(jié)論，TSWV N蛋白所形成的不同形式的低聚物均可與RNA結(jié)合。,構(gòu)建TSWV N 和N-RNA復(fù)合物的同源模型,先前的研究已經(jīng)證實(shí)，TSWV N的大約一半的氨基和羧基與RNA的結(jié)合有關(guān)。然而，由

21、于與RNA結(jié)合有關(guān)的那些帶正電的氨基酸殘基數(shù)量大，而且分布在整個(gè)N的肽鏈上，因此要確定N蛋白與RNA的結(jié)合位點(diǎn)是相當(dāng)有難度的。,為了克服這個(gè)難題，我們直接利用同源建模的方法，模擬出N蛋白以及N-RNA 復(fù)合物的3D結(jié)構(gòu)，通過(guò)直接的觀測(cè)其結(jié)構(gòu)來(lái)確定到底是哪幾個(gè)氨基酸殘基在RNA的結(jié)合中起作用。然后再通過(guò)定點(diǎn)突變，進(jìn)行反向驗(yàn)證。突變由觀察得來(lái)的結(jié)合位點(diǎn)，看看N蛋白與RNA的結(jié)合能力是否發(fā)生改變，從而確定是否是該位點(diǎn)在結(jié)合中起作用，達(dá)到確定結(jié)

22、合位點(diǎn)的目的。,上圖便是通過(guò)I-TASSER程序模擬出來(lái)的TSWV-N的結(jié)構(gòu)，從圖A中可以看出這個(gè)結(jié)構(gòu)由四部分組成，分別是N-末端臂，C-末端臂，N端結(jié)構(gòu)域，C端結(jié)構(gòu)域。圖B是圖A旋轉(zhuǎn)90度的效果圖。N端和C端的臂可能與蛋白低聚物的形成有關(guān)。N端和C端結(jié)構(gòu)域形成了N蛋白的核心結(jié)構(gòu)。N端和C端形成了一個(gè)裂縫可能與RNA的結(jié)合有關(guān),為了進(jìn)一步驗(yàn)證模擬的結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性，我們將與TSWV 病毒同科的其他布尼亞病毒的N結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，將二者重疊，可以

23、發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)構(gòu)出C和N端的臂不同外，主要的核心結(jié)構(gòu)域非常相似而且重疊起來(lái)。這就證明了模擬結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。,模擬一條有11個(gè)核苷酸的RNA鏈與N蛋白結(jié)合，得到E圖的N-RNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。和明顯看出，RNA鏈牢牢的嵌入核心結(jié)構(gòu)域形成的裂縫里，被兩側(cè)的蛋白包裹。對(duì)非結(jié)構(gòu)的表面電荷進(jìn)行分析，得到F圖，在RNA與蛋白的結(jié)合的裂縫的區(qū)域存在大量的正電荷（藍(lán)色區(qū)域）。,確定TSWV N蛋白上的RNA結(jié)合位點(diǎn),通過(guò)對(duì)TSWV N 蛋白的模擬結(jié)構(gòu)的分

24、析，可以推測(cè)N蛋白裂縫區(qū)域的表面正電荷與RNA的結(jié)合有關(guān)。為了確定N蛋白具體哪一個(gè)氨基酸殘基與RNA的結(jié)合相關(guān)，我們從GenBank中調(diào)出20種番茄斑萎病毒N蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)一些帶正電和極性氨基酸都是保守序列，并且這些氨基酸殘基都位于裂縫的區(qū)域。,把這些保守的，帶正電的以及極性的氨基酸作為突變位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。將這些氨基酸突變成丙氨酸。選取十個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行丙氨酸替換。 R60A, K65A/K68A, K81A,

25、R94A/R95A, K183A/Y184A, and K192A/T195A。在E.Coli 中表達(dá)出所有的突變體蛋白，用PEI除去E.Coli的內(nèi)源RNA，然后用Ni-NAT純化。純化出的蛋白在藍(lán)色的4%-16%非變性膠中電泳，各種類型的低聚物得到分離。如下圖所示：,野生型的和突變型的蛋白形成了相似的條帶，說(shuō)明通過(guò)突變對(duì)N蛋白低聚物的形成并未產(chǎn)生實(shí)質(zhì)的影響,為了確定各種突變的蛋白是否都對(duì)與RNA的結(jié)合能力產(chǎn)生了影響，我們分別測(cè)定了突

26、變蛋白R(shí)NA復(fù)合物的解離常數(shù)。首先從凝膠中回收各種突變蛋白，將蛋白與一定量的RNA探針混合（DIG標(biāo)記且包含TSWV末端序列），使二者結(jié)合形成復(fù)合物，采用濾膜結(jié)合法（Filter Binding assay)測(cè)定解離常數(shù)。結(jié)果如下圖所示：,從右側(cè)結(jié)果可以看出，R60A，K65A/K68A,K81A,K192A/T195A這幾個(gè)位點(diǎn)的突變的蛋白復(fù)合物的解離常數(shù)與野生型相差不大，說(shuō)明這些突變并未影響蛋白與RNA的結(jié)合。而K183A/Y184

27、A,R94A/R95A的突變是解離常數(shù)明顯增大，也就是蛋白與RNA的親和力明顯減小。也說(shuō)明蛋白與RNA的結(jié)合與這幾個(gè)位點(diǎn)有關(guān)。,為了進(jìn)一步證實(shí)以上的結(jié)論，我們對(duì)以上的兩種突變體進(jìn)行凝膠遷移分析（Electrophoretic mobility shift assay EMSA）。DIG標(biāo)記的RNA探針?lè)謩e與野生型，R95A/R94A突變型，和K183A/Y184A突變型雜交，并且不斷增加蛋白的含量。然后分別在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，然后

28、檢測(cè)DIG探針。得到下圖結(jié)果：,明顯可以看出突變的蛋白與RNA的結(jié)合能力顯著下降,因此Arg94, Arg95, Lys183, 和 Tyr184這些氨基酸殘基對(duì)蛋白與RNA的結(jié)合起著至關(guān)重要作用，在模擬結(jié)構(gòu)中顯示氨基酸位置發(fā)現(xiàn)這些氨基酸剛好位于蛋白表面的裂縫區(qū)域。,RNA結(jié)合TSWV N蛋白形成復(fù)合物后對(duì)RNA酶的抵抗作用分析,通過(guò)對(duì)N- RNA復(fù)合物的同源建模，我們從3D結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，RNA鏈可以牢牢的嵌入到蛋白表面的裂縫中，并被蛋白

29、分子包裹。由此可以推測(cè)蛋白對(duì)RNA鏈的包裹，可以抵抗RNA酶對(duì)RNA的消化。接下來(lái)通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證。,首先將DIG標(biāo)記的RNA探針（代替RNA）10ng分別與野生型和突變型的N蛋白（2微克）室溫下混合10分鐘，使二者結(jié)合形成N-RNA復(fù)合物,然后加入RNA酶，并且使反應(yīng)體系處于37度，并逐漸增加酶的含量。同時(shí)不混合蛋白的RNA探針也被相同條件的酶處理，作為對(duì)照。,最后，將樣品加到1%的瓊脂糖凝膠中固定，用地高辛（DIG）免疫抗體檢測(cè)RN

30、A探針。,根據(jù)是否檢測(cè)到RNA判斷RNA是否被酶消化，也就是蛋白復(fù)合物是否可以保護(hù)RNA，抵抗RNA酶的消化。,,,在圖Ａ中，當(dāng)加入0.005 μg/ml 的RNA酶時(shí)N-RNA的條帶變得分散，這可是由于復(fù)合物的局部分解照成的，逐漸增加RNA的量，發(fā)現(xiàn)依然能檢測(cè)到RNA，說(shuō)明N-RNA復(fù)合物可以保護(hù)RNA免遭酶的消化。圖B，C為突變的蛋白復(fù)合物，在加入RNA酶后，條帶消失，RNA被消化。由以上的實(shí)驗(yàn)可知這兩個(gè)類型的突變蛋白與RNA的親

31、和性很低，不能有效與蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，所以很快被消化。Free RNA是只有RNA探針的對(duì)照，同樣加入RNA酶后條帶消失，被消化。,方法,結(jié)果,謝 謝 ！,番茄斑萎病毒ＴＳＷＶ,TSWV是番茄斑萎病毒屬（病原拉丁學(xué)名Tomato spotted wilt virus）的代表種。屬于布尼亞病毒科（ Bunia virus）病毒粒子為球形，直徑約85nm,表面有一層膜包裹，膜外層由5nm厚幾乎連續(xù)的突起層組成，染色較包膜要深，純化的病

32、毒粒子有時(shí)出現(xiàn)尾巴狀的擠出物。,核酸：該病毒包裹三分子線性ssRNA,基因組總長(zhǎng)約為16600nt,其中ssRNA-L長(zhǎng)8897nt，ssRNA-M長(zhǎng)4821nt，ssRNA-S長(zhǎng)2316nt,核酸約占病毒粒子重量的1%~2%。蛋白質(zhì)：含有4種結(jié)構(gòu)蛋白，糖蛋白G1的分子量為78kDa,G2的分子量為58kDa, ，一種大的蛋白L可能是轉(zhuǎn)錄酶，分子質(zhì)量為200kDa。外殼蛋白N的分子質(zhì)量為28.8kDa基因組：三分體基因組，其中ssR

33、NA-L為負(fù)義，ssRNA-M和ssRNA-S為雙義，各個(gè)基因組片段具共有末端序列，在3‘端是CUCGUUA···，在5’端是AGAGCAAU···，區(qū)域互補(bǔ)而形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)。番茄斑萎病毒的L片段編碼一個(gè)332kDa的多聚酶；M片段的互補(bǔ)鏈RNA編碼兩個(gè)糖蛋白G1和G2，病毒鏈RNA編碼33. 6kDa非結(jié)構(gòu)蛋白NSm；S片段的互補(bǔ)鏈RNA編碼28.8kDa外殼蛋白，病毒鏈RN

34、A編碼52.4kDa非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。NSm蛋白在病毒系統(tǒng)侵染中起到胞間運(yùn)動(dòng)作用，NSs在寄主細(xì)胞中可形成擬結(jié)晶狀或纖維狀內(nèi)含體，其功能未知。該屬有6種病毒的L，M，S三個(gè)RNA片段已測(cè)序或部分測(cè)序。,,同源建模Homology Modeling,基因復(fù)制和趨異進(jìn)化機(jī)制產(chǎn)生了同源蛋白質(zhì)族系。蛋白質(zhì)的同源性使人們有可能根據(jù)已知蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)去推測(cè)未知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)的初步結(jié)構(gòu)。人們通過(guò)對(duì)類似蛋白空間結(jié)構(gòu)的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，蛋白三維結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)的

35、一級(jí)結(jié)構(gòu)更加保守，而后者又比DNA序列更為保守。氨基酸殘基的替換通常發(fā)生在蛋白表面回折區(qū)域，蛋白的主鏈結(jié)構(gòu)，特別是疏水核心的結(jié)構(gòu)受序列變異的影響很小。因此，用類似物來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)是比較可靠的方法,利用同源蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模，其基本出發(fā)點(diǎn)是同一家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上得保守性比序列保守性更強(qiáng)。當(dāng)序列相似性大于30%時(shí)，同源模型的可靠性很高，否則，結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的較差。,同源建模法是現(xiàn)在最為成熟的預(yù)測(cè)方法，不但有商業(yè)化軟件（I-TASSER htt

36、p://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/ ）可以使用，而且有自動(dòng)同源建模網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對(duì)公眾免費(fèi)開(kāi)放，比如瑞士生物信息研究所的SWISS-MOD-EL,丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心的CPHmodels等。,,Ni-NTA親和層析法純化蛋白,純化帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白的常見(jiàn)方法。,原理：純化用的Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白結(jié)合，組蛋白標(biāo)簽一般是6個(gè)組氨酸。在蛋白上樣后，帶有

37、組氨酸標(biāo)簽的蛋白特異性的結(jié)合到柱子里，其他蛋白流出。洗脫：Ni柱上得氯化鎳或硫酸鎳也可以與咪唑結(jié)合，并且結(jié)合能力較蛋白強(qiáng)，這時(shí)候用咪唑梯度洗脫，咪唑競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合到柱上，重組蛋白就被洗脫了。收集浸出液，透析過(guò)濾掉殘留的咪唑，就得到了純化的重組蛋白。,,藍(lán)色溫和凝膠電泳,為了研究哺乳動(dòng)物和真菌線粒體中的蛋白復(fù)合物，人們建立了一種溫和膠電泳系統(tǒng)，并稱之為藍(lán)色溫和凝膠電泳（Blue Native Gel Electrophoresis

38、 BN-PAGE）。該電泳系統(tǒng)是常見(jiàn)分離蛋白復(fù)合物的方法。,電泳之前，在蛋白樣品中加入考馬斯亮藍(lán)（ Coomassie Brilliant Blue G-250）使蛋白帶上負(fù)電荷，同時(shí)不破壞蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，使蛋白復(fù)合物在近似天然的狀態(tài)下分離。,該該電泳系統(tǒng)有兩種凝膠系統(tǒng)。一種是梯度凝膠，可以分離不同大小分子量的蛋白復(fù)合物。另一種是勻膠系統(tǒng)，主要分離具有相似分子量的蛋白復(fù)合物。一般情況下都用丙烯酰胺濃度梯度膠，在極少的情況下使用勻膠系統(tǒng)

39、。,,,凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn),凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（ Electrophoretic mobility shift assay EMSA）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用,在該實(shí)驗(yàn)中，3nmol的DIG標(biāo)記的RNA探針?lè)謩e與逐漸增多的N蛋白和突變N蛋白混合，反應(yīng)體系中加入10 μl的

40、結(jié)合緩沖液，并且一同在室溫下保溫10min,使探針與蛋白結(jié)合。然后在含有TBE緩沖液的1%瓊脂糖中電泳。最后用DIG免疫抗體檢測(cè)探針。從而分析RNA與蛋白的作用。,,濾膜結(jié)合法測(cè)定蛋白復(fù)合物的解離常數(shù),該過(guò)濾系統(tǒng)由兩層膜構(gòu)成，第一層是硝酸纖維素薄膜，第二層是尼龍膜。由于RNA探針帶負(fù)電，硝酸纖維素薄膜也帶負(fù)電，所以RNA可以透過(guò)。而大部分蛋白的表面都帶有正電荷，所以蛋白不能透過(guò)，同樣蛋白核酸的復(fù)合也不能透過(guò)。通過(guò)定量過(guò)濾液中的RNA以及