儀器分析實(shí)驗(yàn)

1、儀 器 分 析 實(shí) 驗(yàn),漆紅蘭,honglanqi@snnu.edu.cn,8202,儀器分析實(shí)驗(yàn),組成：共6個實(shí)驗(yàn)，分6個大組光 3個實(shí)驗(yàn) （紫外-可見、熒光、原子吸收）紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量（2組）熒光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的含量（2組）原子吸收光譜法測定鈣最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇（1組）電 1個實(shí)驗(yàn)循環(huán)伏安法測定亞鐵氰化鉀（2組）色譜 2個實(shí)驗(yàn)（氣相色譜、液相色譜）苯、甲苯、乙苯混合物的分

2、離與定量分析（1組）反相色譜法測定樣品中尼泊金甲酯的含量（1組）儀器參觀 1個實(shí)驗(yàn)（1組，附加） pH計的使用 （2組，附加）,注意事項：實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報告（檢查、記錄數(shù)據(jù)、簽字）實(shí)驗(yàn)報告（數(shù)據(jù)記錄和處理）實(shí)驗(yàn)服、實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生、實(shí)驗(yàn)室安全和路途安全實(shí)驗(yàn)小組（6組，輪流實(shí)驗(yàn)，6周）,儀器分析定性分析定量分析方法的評價指標(biāo) 一、標(biāo)準(zhǔn)曲線二、靈敏度三、精密度四、檢出限五、準(zhǔn)確度,一、標(biāo)準(zhǔn)曲線 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3、 標(biāo)準(zhǔn)曲線又稱校準(zhǔn)曲線，是被測物質(zhì)的濃度或量與儀器響應(yīng)信號的關(guān)系曲線，用標(biāo)準(zhǔn)溶液或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線是依據(jù)一系列被測物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（或含量）和其響應(yīng)信號測量值來繪制的。只要在與校準(zhǔn)曲線的相同的實(shí)驗(yàn)條件下測得樣品溶液的峰電流，即可在校準(zhǔn)曲線上求得樣品溶液中被測物質(zhì)的濃度C。 3. 線性范圍 校準(zhǔn)曲線的直線部分所對應(yīng)的被測物質(zhì)的濃度或量的范圍叫作該方法測定這種物質(zhì)的線性范圍。一般說

4、來，好的分析方法應(yīng)有較寬的線性范圍。,圖1-1 伏安法校準(zhǔn)曲線曲線的橫坐標(biāo)是試液的濃度C縱坐標(biāo)是峰電流,,這種線性關(guān)系可以用一元線性回歸法求出 b 叫回歸系數(shù)即回歸直線斜率，也就是方法的靈敏度。 r 叫相關(guān)系數(shù)，表示線性關(guān)系的好壞。r值在+1.0000與-1.0000之間。當(dāng)越接近1，則y與x之間的線性關(guān)系就越好。,二、靈敏度（Sensitivity） 被測物質(zhì)單位濃度或單位質(zhì)量的變化引起響應(yīng)信號值變化的程度

5、，稱為方法的靈敏度，用S表示。 根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（簡稱IUPAC）的規(guī)定，靈敏度是指在測定濃度范圍中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。在分析化學(xué)中使用的許多標(biāo)準(zhǔn)曲線都是線性的，一般是通過測量一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液來求得，可用下式表示：式中：dc 和dm 分別為被測物質(zhì)的濃度和質(zhì)量的變化量，dx為響應(yīng)信號的變化量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率越大，方法的靈敏度就越高。,三、精密度(precision),使用同一方法，對同一試樣進(jìn)行多次測定所得結(jié)果的一致程度

6、（重復(fù)性和再現(xiàn)性）。重復(fù)性 同一分析人員在同一條件下平行測定結(jié)果的精密度又稱重復(fù)性。再現(xiàn)性 不同實(shí)驗(yàn)室所得測定結(jié)果的精密度又稱再現(xiàn)性。精密度常用測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差s或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差量度。,,四、檢出限（Detection Limit） 某一方法在給定的置信水平上可以檢出被測物質(zhì)的最小濃度或最小質(zhì)量稱為這種方法對該物質(zhì)的檢出限，以濃度表示的稱為相對檢出限，以質(zhì)量表示的稱為絕對檢出限。檢出限是一個定性概念，只表明此濃度或量的

7、響應(yīng)信號可以與空白信號相區(qū)別。在檢出限附近不能進(jìn)行定量分析。對于光學(xué)分析方法，可以與空白信號區(qū)別的最小信號XL。以下式確定,,式中Xb為空白信號的平均值，sb為空白信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為根椐一定的置信水平確定的系數(shù)，IUPAC(國際純粹及應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會)建議k值取3。能產(chǎn)生響應(yīng)信號為XL-Xb的被測物質(zhì)的濃度或量就是方法對該物質(zhì)的檢出限，用DL表示。,,式中S是方法的靈敏度。1位有效數(shù)字,檢出限與靈敏度關(guān)系靈敏度高，精密度好，檢出限低

8、靈敏度是分析信號隨被測物質(zhì)含量變化的大小，與儀器信號的放大倍數(shù)有關(guān)檢出限與空白信號波動或儀器噪音相關(guān)，具有明確的統(tǒng)計學(xué)含義。檢出限是方法靈敏度和精密度的綜合指標(biāo),五、準(zhǔn)確度(Accuracy) 樣品含量的測定值與樣品含量真實(shí)值(亦稱真值)相符合的程度稱為準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度常用相對誤差量度。,,式中x為樣品含量的測定值，μ為樣品含量的真值。 準(zhǔn)確度是分析過程中系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差的綜合反映，它決定著分析結(jié)果的可靠程度。方

9、法有較好的精密度且消除了系統(tǒng)誤差后，才有較好的準(zhǔn)確度。,“3S+2A”，即Sensitivity（靈敏度）， Selectivity（選擇性），Speediness（速度）, Accuracy（準(zhǔn)確度）, Automation（自動化程度）IUPAC建議將精密度、準(zhǔn)確度和檢出限三個指標(biāo)作為分析方法的主要評價指標(biāo)。,“3S+2A”,用某伏安分析新分析法測定試樣中的鉛離子濃度，獲得如下數(shù)據(jù)：,說明：空白溶液測定10次，標(biāo)準(zhǔn)偏差s為0.02

10、4 (mg/mL，這個值要自己會計算), 標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)為3次。（1）試?yán)L制標(biāo)準(zhǔn)曲線；（2）寫出標(biāo)準(zhǔn)曲線的一元線性回歸方程，確定其線性范圍和該方法的靈敏度； 3）試計算該方法的檢出限。,解：（1）利用實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)在Excel軟件表中按濃度為A列和峰電流平均值為B列制表。使用Excel軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖。,（2）使用Excel軟件繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1-3。由圖1-3確定一元線性回歸方程為I(nA)=6.915c +0.036

11、( c單位為mg/mL), 相關(guān)系數(shù)平方值為0.9997，線性范圍為0.02~0.22 mg/mL，方法在線性范圍內(nèi)的靈敏度為6.915 nA/ mg/mL。,線性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,（3）計算該方法的檢出限為：,（mg/mL）,定量分析方法,標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)加入法歸一化法（色譜）,紫外-可見吸收光譜法,又稱紫外-可見分光光度法，是以溶液中物質(zhì)的分子或離子對紫外和可見光譜區(qū)輻射能的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外光：10-40

12、0 nm可見光：400-780 nm，可被人們的眼睛所感覺特點(diǎn)：帶光譜 分子光譜應(yīng)用：定性分析-最大吸收波長 定量分析-朗伯-比爾定律（標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法）,定性分析原理,吸收曲線：吸收峰的數(shù)目、位置、相對強(qiáng)度以及吸收峰的形狀,根據(jù)朗伯－比耳定律：A=εbc，當(dāng)入射光波長λ及光程b一定時，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比。 標(biāo)準(zhǔn)曲線法：只要繪出以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度c為

13、橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出試液的吸光度，就可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對應(yīng)的濃度值，即未知樣的含量。,定量分析原理,儀器組成部件 各種類型的紫外-可見分光光度計，如下圖所示，從總體上來說是由五個部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測器和信號顯示記錄裝置。,紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,學(xué)習(xí)紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的原理。掌握紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 掌握TU-1901紫外-可見分光光度計的使用方法并了解此

14、儀器的主要構(gòu)造。,,,,,定性、定量（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）,本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白質(zhì)吸收波長略有差別）。在最大吸收波長處，吸光度與蛋白質(zhì)溶液的濃度的關(guān)系服從朗伯-比耳定律。,280nm,275nm,實(shí)驗(yàn)原理,實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí),預(yù)習(xí)紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的原理。預(yù)習(xí)紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)步驟。

15、了解TU-1901紫外-可見分光光度計的主要構(gòu)造。,TU-1901紫外-可見分光光度計，比色管，吸量管標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：3.00 mg.mL-1溶液0.9% NaCl溶液，待測蛋白質(zhì)溶液（牛血清白蛋白）,儀器與試劑,1. 啟動計算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動工作站并初始化儀器。2. 在工作界面上選擇測量項目（光譜掃描，光度測量），本實(shí)驗(yàn)選擇光度測量，設(shè)置測量條件（測量波長等）。3. 將空白放入測量池中，點(diǎn)擊START掃描空白，點(diǎn)

16、擊ZERO校零。4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。,基本操作,實(shí)驗(yàn)步驟,1.吸收曲線的繪制和最大吸收波長的選擇： 用吸量管分別吸取1.0 mL 3.00 mg.mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。 用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在190-400 nm區(qū)間，掃描獲得吸收曲線。選擇最大吸收波長。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ： 用吸量管分別吸取0.5 、1

17、.0、 1.5 、2.0 、2.5 mL 3.00 mg.mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。 用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm（選定波長下）處分別測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A280，記錄所得讀數(shù)。3. 樣品測定： 取待測蛋白質(zhì)溶液3 mL，按上述方法測定280 nm處的吸光度。平行測定三份。,繪制吸收曲線。以蛋白質(zhì)濃度為橫

18、坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3. 根據(jù)樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度。,數(shù)據(jù)處理,分子發(fā)光分析法,分子發(fā)光分析法包括分子熒光分析法，磷光分析法、化學(xué)發(fā)光分析法和生物發(fā)光分析法。,實(shí)驗(yàn)原理,常溫下，處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長長的光而產(chǎn)生熒光。 在稀溶液中，熒光強(qiáng)度IF與

19、物質(zhì)的濃度c有以下的關(guān)系： 當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系： 這是熒光光譜法定量分析的理論依據(jù)。,a. 與紫外-可見分光度法比較，熒光分析法具有更高的靈敏度。b. 選擇性好。熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來鑒定物質(zhì)。c. 所需試樣量少、操作方法簡便。,激發(fā)光譜：固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的

20、分子最多，熒光強(qiáng)度最大。發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長), 化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。 固定發(fā)射光波長進(jìn)行激發(fā)光波長掃描，找出最大激發(fā)光波長，然后固定激發(fā)光波長進(jìn)行熒光發(fā)射波長掃描，找出最大熒光發(fā)射波長。激發(fā)光波長和發(fā)射熒光波長的選擇是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。,激發(fā)光譜,發(fā)射光譜,常用的熒光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、液槽、檢測器和顯示記錄器五部分構(gòu)成，如下圖所示：熒光分析儀器與分光光度計比較主要差別有兩點(diǎn)

21、：a.熒光分析儀器采用垂直測量方式，以消除透射光的影響；b.熒光分析儀器有兩個單色器，能夠獲得單色性較好的激發(fā)光并消除其它雜散光干擾。,a.光源：在熒光計中常用鹵鎢燈作光源；熒光分度計常采用高壓汞燈或氙弧燈做光源。b.單色器：熒光計的單色器是濾光片，只能用于定量分析；熒光分光光度計采用兩個光柵單色器，可獲得激發(fā)光譜和熒光光譜。c.檢測器：熒光計采用光電管作檢測器；熒光分光光度計采用光電倍增管作檢測器。,儀器部件,熒光分光光度法測

22、定多維葡萄糖粉中維生素B2的含量,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,學(xué)習(xí)熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的分析原理。掌握熒光分光光度計的操作技術(shù)和測定多維葡萄糖粉中維生素B2 的方法。,,,,,定性、定量（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）,維生素B2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為：維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。,維生素B2溶液在430～440 nm藍(lán)光的照射下，發(fā)出綠色熒

23、光，其峰值波長為525 nm。VB2的熒光在pH=6～7時最強(qiáng)，在pH=11時消失。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多，故測VB2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行。 多維葡萄糖中含有維生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中維生素C和葡萄糖在水溶液中不發(fā)熒光，維生素B1本身無熒光，在堿性溶液中用鐵氰化鉀氧化后才產(chǎn)生熒光，維生素D2用二氯乙酸處理后才有

24、熒光，他們都不干擾維生素B2的測定。,實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí),預(yù)習(xí)熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的分析原理。了解熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。了解熒光光度計的操作步驟和測定多維葡萄糖粉中維生素B2 的方法。,970CRT熒光光度計（上海分析儀器總廠）5 mL吸量管1只，2 mL吸量管1只， 50 mL容量瓶7只10.0μg·mL-1VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液（置陰暗處保存），冰乙酸（AR）， 多維葡萄糖粉試樣,儀器與試劑,1. 打開氙

25、燈，再打開主機(jī)，然后打開計算機(jī)啟動工作站并初始化儀器。2. 儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測量項目，設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù)：激發(fā)波長= 440 nm（選擇），發(fā)射波長=540 nm（選擇）。3. 樣品測定。4. 退出主程序，關(guān)閉計算機(jī)，先關(guān)主機(jī)，最后關(guān)氙燈。,基本操作,1. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度的測定： 在六個干凈的50 mL容量瓶中，分別吸取0.50、1.00、1.50，2.00 、2.50和3.00 m

26、L VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入2.00 mL冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。 任取一份溶液，繪制激發(fā)光譜和發(fā)射光譜曲線，選擇最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。在選定的條件下，從稀到濃測量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。2. 未知試樣的測定: 稱取0.15-0.20 g多維葡萄糖粉試樣,用少量水溶解后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，加2.00 mL冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。用測定標(biāo)準(zhǔn)系列時相同的條件，測量其熒光強(qiáng)度。,實(shí)驗(yàn)步驟,1. 用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒

27、光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。2. 根據(jù)待測液的熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得其濃度，計算出試樣中VB2含量。,數(shù)據(jù)處理,1. 試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因。2. 本實(shí)驗(yàn)為何在酸性溶液中測定維生素B2？,注意事項和問題,原子吸收光譜法,原子吸收光譜法(Atomic Absorption Spectrometry，AAS) 是根據(jù)物質(zhì)的基態(tài)原子蒸氣對特征輻射的吸收作用來進(jìn)行元素定量分析的方法。1.特點(diǎn) (1) 檢出限低，10

28、-10～10-14 g； (2) 準(zhǔn)確度高，1%～5%； (3) 選擇性高，一般情況下共存元素不干擾； (4) 應(yīng)用廣，可測定70多個元素（各種樣品中）；2. 缺點(diǎn)：難熔元素、非金屬元素測定困難，不能進(jìn)行多元素同時測定。,原子吸收光譜儀（原子吸收分光光度計）主要由銳線光源、原子化器、分光系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和電源同步調(diào)制系統(tǒng)五部分組成。,,原子吸收光譜法測定鈣最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,

29、學(xué)習(xí)原子吸收光譜法最佳實(shí)驗(yàn)條件選擇的方法。掌握火焰原子吸收分光光度計的使用方法。,,,定量（條件選擇）,在原子吸收測定中，實(shí)驗(yàn)條件的選擇直接影響到測定的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度和方法的選擇性。本實(shí)驗(yàn)通過對一系列實(shí)驗(yàn)條件（包括燃?xì)獾牧髁勘?、燈電流、單色器通帶寬度以及燃燒器高度和位置）等的選擇和優(yōu)化，選定測定鈣的最佳實(shí)驗(yàn)條件。 助燃比不同，火焰的溫度和性質(zhì)不同，因而元素的原子化程度不同。通常固定空氣流量，改變?nèi)?/p>

30、氣流量來改變助燃比。在不同助燃比時測定吸光度，吸光度最大的助燃比為最佳助燃比。,實(shí)驗(yàn)原理,乙炔-空氣火焰的種類,燈電流的選擇要從靈敏度和穩(wěn)定性兩方面來考慮。燈電流過大，易產(chǎn)生自吸作用，多普勒效應(yīng)增強(qiáng)，譜線變寬，測定靈敏度降低，工作曲線彎曲，燈的壽命減小。燈電流低，譜線變寬小，測定靈敏度高，但是燈電流過低，發(fā)光強(qiáng)度減弱，陰極發(fā)光不穩(wěn)定，因而譜線信躁比降低。一般的原則是在保證穩(wěn)定和適當(dāng)?shù)墓鈴?qiáng)輸出的情況下，盡可能選擇較低的燈電流。,,,通帶寬

31、度的選擇以能將吸收線和鄰近線分開為原則。通帶較窄，靈敏度較高，但躁聲較大，信躁比不一定高。對許多元素來說，為了得到最大信躁比、較高的靈敏度以及較寬的校正曲線，要求有0.2 nm通帶寬度。 火焰的部位不同，其溫度和還原氣氛不同，因而被測元素基態(tài)原子的濃度隨火焰高度的不同而不同。在實(shí)驗(yàn)中通過改變?nèi)紵鞲叨炔y定吸光度，以吸光度最大時的燃燒器高度為最佳燃燒器高度。,實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí),預(yù)習(xí)原子吸收光譜法最佳實(shí)驗(yàn)條件選

32、擇的方法。了解火焰原子吸收分光光度計的原理和使用方法。,TAS-986型原子吸收分光光度計乙炔鋼瓶，空氣壓縮機(jī)鈣空心陰極燈100.0 µg/mL鈣離子儲備液,儀器和試劑,1. 溶液的配制：5.00 µg/mL鈣離子標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取 100.0 µg/mL鈣離子標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL于100 mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻。 2. 最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇 ：(1) 燃?xì)饬髁康倪x擇 改變乙炔流

33、量為1.2、1.5、1.8、2.0 L/min，在每一乙炔流量下測定5.00 µg/mL鈣離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。作吸光度-乙炔流量曲線，曲線上最大吸光度所對應(yīng)的燃?xì)饬髁考礊樽罴讶細(xì)饬髁?。,實(shí)驗(yàn)步驟,(2) 燈電流的選擇 在選定的最佳助燃比及燃燒器高度條件下，分別在燈電流為1、1.5、2、2.5 mA時噴霧5.00 µg/mL 鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，測量吸光度，并觀察不同燈電流的穩(wěn)定性。讀數(shù)穩(wěn)定及大的吸光度所對應(yīng)的燈電 流

34、即為最佳燈電流 。(3) 狹縫寬度的選擇 在上述選定的實(shí)驗(yàn)條件下，將狹縫寬度分別置于0.1 nm、0.2 nm、0.4 nm處，噴霧5.00 µg/mL鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，測量吸光度。選擇不引起吸光度減小的最大狹縫為最佳狹縫寬度。 (4) 測量結(jié)束后用高純水沖洗原子化器2min，先關(guān)乙炔氣再關(guān)空氣。(5) 退出工作站，關(guān)閉計算機(jī)，關(guān)閉Tas986電源開關(guān)。,1. 繪制吸光度-乙炔流量曲線，曲線上最大吸光度所對應(yīng)的燃?xì)饬考礊樽罴褩l件

35、。2. 繪制吸光度-燈電流曲線，讀數(shù)穩(wěn)定且大的吸光度所對應(yīng)的燈電流即為最佳燈電流。 3. 繪制吸光度-狹縫寬度曲線，吸光度最大處的狹縫寬度為最佳條件。 4. 綜合上述條件，得出測鈣的最佳實(shí)驗(yàn)條件。,數(shù)據(jù)處理,,循環(huán)伏安法測定亞鐵氰化鉀,定性、定量（電流濃度定量關(guān)系的驗(yàn)證及其方法應(yīng)用）,實(shí)驗(yàn)原理,在一定掃描速率下，從起始電位（-0.2 V）正向掃描到轉(zhuǎn)折電位（+0.8 V）期間，溶液中[Fe(CN)6]4-被氧化生成[Fe(CN)6

36、]3-，產(chǎn)生氧化電流；當(dāng)負(fù)向掃描從轉(zhuǎn)折電位（+0.8 V）變到原起始電位（-0.2 V）期間，在指示電極表面生成的[Fe(CN)6]3- 被還原生成[Fe(CN)6]4- ，產(chǎn)生還原電流。,,i—E曲線,為了使液相傳質(zhì)過程只受擴(kuò)散控制，應(yīng)在加入電解質(zhì)和溶液處于靜止下進(jìn)行電解。 實(shí)驗(yàn)前電極表面要處理干凈。 在0.10 mol·L-1 NaCl溶液中[Fe(CN)6]的擴(kuò)散系數(shù)為0.63×10-5

37、 cm·s-1；電子轉(zhuǎn)移速率大，為可逆體系（1.0 mol·L-1 NaCl溶液中，25℃時，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)速率常數(shù)為5.2×10-2 cm·s-1）。,從循環(huán)伏安圖上讀取以下數(shù)據(jù),計算,作圖并驗(yàn)證以下公式,電極過程可逆性計算電極面積、擴(kuò)散系數(shù)等電化學(xué)參數(shù)表面過程,實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí),預(yù)習(xí)循環(huán)伏安法的原理。預(yù)習(xí)循環(huán)伏安儀的使用技術(shù)。了解掃描速率和濃度對循環(huán)伏安圖的影響。學(xué)習(xí)計算電極面積的方法。,CHI電

38、化學(xué)分析系統(tǒng)；鉑盤電極；鉑柱電極，飽和甘汞電極；電解池大多電解池以玻璃制造（偶有石英），可以根據(jù)需要加工設(shè)計成各種形狀,儀器與試劑,,0.50 mol·L-1 K4 [Fe(CN)6]; 1.0 mol·L-1 NaCl,飽和甘汞電極,電解池,實(shí)驗(yàn)步驟,1. 指示電極的預(yù)處理： 鉑電極用Al2O3粉末（粒徑0.05 µm）將電極表面拋光，然后用蒸餾水清洗。,3. 不同濃度K4[Fe(CN)6]溶液的循環(huán)

39、伏安圖: 分別作0.010 mol·L-1、0.020 mol·L-1、0.040 mol·L-1、0.060 mol·L1、0.080 mol·L-1的K4 [Fe(CN)6]溶液（均含支持電解質(zhì)NaCl濃度為0.10 mol·L-1）循環(huán)伏安圖，掃速為50 mV·s-1 。4. 不同掃描速率K4 [Fe(CN)6]溶液的循環(huán)伏安圖: 在0.040 mol&

40、#183;L-1 K4 [Fe(CN)6]溶液中，以10 mV·s-1、20 mV·s-1、30 mV·s-1、50 mV·s-1、80 mV·s-1、100 mV·s-1，在-0.2至+0.8 V電位范圍內(nèi)掃描，分別記錄循環(huán)伏安圖。,1. 從K4 [Fe(CN)6]溶液的循環(huán)伏安圖上，讀取ipa、 ipc、 、 的值。2. 分別以ipa、 ipc對K4 [Fe

41、(CN)6]溶液的濃度作圖，說明峰電流與濃度的關(guān)系。 3. 分別以ipa 、 ipc對v1/2作圖，說明峰電流與掃描速率間的關(guān)系。4. 計算ipa/ ipc的值、 值和 值；說明K3 [Fe(CN)6]在KCl溶液中電極過程的可逆性。,數(shù)據(jù)處理,1. 實(shí)驗(yàn)前電極表面要處理干凈。2. 掃描過程保持溶液靜止。3. 設(shè)計一測定擴(kuò)散系數(shù)的電化學(xué)方法。,注意事項和問題,分離與分析技術(shù),色譜法是一種分離技術(shù)。試樣混合物的分離

42、過程也就是試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分配過程。 其中的一相固定不動，稱為固定相； 另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。 氣相色譜：流動相為氣體（稱為載氣）；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜 液相色譜：流動相為液體（稱為淋洗液）。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。,氣相色譜法的特點(diǎn),（1）分離效率高： 復(fù)雜混合物，有

43、機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2） 靈敏度高： 可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量.（3） 分析速度快： 一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。（4） 應(yīng)用范圍廣： 適用于沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。 不足之處： 不適用于高沸點(diǎn)、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析。 被分離

44、組分的定性較為困難。,氣相色譜流程,1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計;6-壓力表；4-針形閥；5-流量計;6-壓力表；9-熱導(dǎo)檢測器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；,1. 載氣系統(tǒng)：包括氣源、凈化干燥管和載氣流速控制;2. 進(jìn)樣系統(tǒng)：進(jìn)樣器及氣化室；3. 色譜柱：填充柱（填充固定相）或毛細(xì)管柱（內(nèi)壁涂有固定液）；4. 檢測器：可連接各種檢測器，以熱導(dǎo)檢測器或氫火焰檢測器最為常見；5

45、. 記錄系統(tǒng)：放大器、記錄儀或數(shù)據(jù)處理儀；6. 溫度控制系統(tǒng)：柱室、氣化室的溫度控制。,高效液相色譜是20世紀(jì)70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)。他是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，引入氣相色譜理論，在技術(shù)上采用高壓輸壓泵、梯度洗脫技術(shù)、新型高效填充劑及各種高靈敏度監(jiān)測器。高效液相色譜與氣相色譜比較，可供選擇的流動相種類較多，從有機(jī)溶劑到水溶劑，既能用純?nèi)軇┯挚捎枚蚨嘣旌先軇⒖扇我庹{(diào)配比例，通過改變?nèi)軇O性或強(qiáng)度繼而改變色譜

46、柱效能、分離選擇性和組分的容量因子，最后實(shí)現(xiàn)改善色譜系統(tǒng)分離度的目的。,高效液相色譜,1. 分析速度快。2. 分離效率高。3. 靈敏度高、易于實(shí)現(xiàn)操作自動化。4. 適用于高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。,,進(jìn)樣裝置,流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置， 其結(jié)構(gòu)如圖所示：,紫外光度檢測器（UV）：最小檢測量10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。

47、 最常用的檢測器。,定性方法：1. 利用純物質(zhì)定性的方法 利用保留值定性：通過對比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對比。 利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對變化。2.利用文獻(xiàn)保留值定性,常用的幾種定量方法 （1）歸一化法：若試樣中含有n個組分，且各組分均能洗出色譜峰，則其中某個組分的質(zhì)量可按下式計算,特

48、點(diǎn)及要求： 歸一化法簡便、準(zhǔn)確； 進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性和操作條件的變動對測定結(jié)果影響不大； 僅適用于試樣中所有組分全出峰的情況。,（3）外標(biāo)法,外標(biāo)法也稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線法。,特點(diǎn)及要求： 外標(biāo)法不使用校正因子，準(zhǔn)確性較高; 操作條件變化對結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大; 對進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析。,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握氣相色譜法分離多組分混合物的方法。練習(xí)用歸一化法定量測定混合物中各組分的含量。,,苯、甲

49、苯、乙苯混合物的分離和定量分析,,定性、定量（歸一化法）,定量方法： 歸一化法：若試樣中含有n個組分，且各組分均能洗出色譜峰，則其中某個組分的質(zhì)量可按下式計算。,了解氣相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及操作步驟。掌握利用歸一化法分析混合物中各組分含量的方法。,實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí),1. 色譜儀: 氣相色譜儀，熱導(dǎo)池檢測器，微量注射器（10mL）2. 色譜柱：2 m×5 mm3. 固定相: 15%鄰苯二甲酸二壬酯；102白色擔(dān)體60~80目

50、，載氣：氮?dú)?. 苯、甲苯、乙苯。三組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：苯、甲苯、乙苯重量比為：1：1：2。三組分混合樣品。,儀器與試劑,基本操作,1. 打開電腦主機(jī)，再打開氣相色譜的模塊，啟動工作站并初始化儀器。2. 開機(jī)調(diào)試，按下列參考色譜條件將儀器調(diào)至所需工作狀態(tài)。氣化室溫度：150 柱溫：100 檢測器溫度：200 3. 運(yùn)行程序，清洗色譜柱，直至基線平穩(wěn)，然后進(jìn)樣，進(jìn)行測定。4. 測定結(jié)束后，依次用純水、100%甲醇

51、洗滌20分鐘，退出主程序，關(guān)閉計算機(jī)。,定性分析：儀器穩(wěn)定后，用10mL注射器進(jìn)2.0mL混合樣品和5mL空氣，記錄色譜圖（I）。在完全相同的條件下，分別進(jìn)苯、甲苯、乙苯純試劑，每次進(jìn)樣2mL試劑，記錄色譜圖（II），測定校正因子 。混合物的定量 進(jìn)2.0mL三組分混合樣品，記錄色譜圖（IV）。,實(shí)驗(yàn)步驟,數(shù)據(jù)處理,1. 準(zhǔn)確測量色譜圖I~IV各峰的保留時間tR和死時間t0,比較個純是基于混合物中各峰的保留值，確定各峰是什么物質(zhì)

52、。2. 計算甲苯和乙苯的校正保留時間和對苯的保留值。3. 測量各峰的峰面積，以苯為標(biāo)準(zhǔn)，求出其余兩組分的相對重量校正因子（重量校正因子的文獻(xiàn)值為：苯：0.780，甲苯：0.794，乙苯：0.818）4. 采用歸一化法求出混合物中各組分的百分含量。相對校正因子,未知液中甲苯的含量,,進(jìn)樣量準(zhǔn)確與否是否會影響歸一化法的分析結(jié)果？ 2. 能否從理論上揭示本實(shí)驗(yàn)的出峰順序? 3. 進(jìn)樣器要充分洗滌。,注意事項和問題,,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,了

53、解高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及基本操作。了解反相色譜法的基本原理。掌握利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行色譜定量分析的實(shí)驗(yàn)方法。,,,,反相色譜法測定尼泊金甲酯的含量,定性、定量（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）,了解高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及操作步驟。掌握利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行色譜定量分析的實(shí)驗(yàn)方法。,實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí),1. 色譜儀: Agilent 11002. 色譜柱：C18柱， 250 mm×4.6 mm3. 流動相: 甲醇:水(70:30)，流速:

54、1.0 mL/min4. 檢測器: 紫外檢測器 254 nm 5. 尼泊金甲酯,儀器與試劑,尼泊金甲酯，又稱羥基苯甲酸甲酯，白色結(jié)晶粉末或無色結(jié)晶，易溶于醇，醚和丙酮，極微溶于水，沸點(diǎn)270-280℃。主要用作有機(jī)合成、食品、化妝品、醫(yī)藥的殺菌防腐劑，也用作于飼料防腐劑。采用外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）定量時，首先在一定條件下，測定一系列不同濃度的尼泊金甲酯標(biāo)品的峰面積，繪出峰面積A對濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在嚴(yán)格相同的操作條件下，測定試樣中待

55、測組分尼泊金甲酯的峰面積，由測得的峰面積在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出被測組分的濃度。,基本操作,1. 打開電腦主機(jī)，再打開高效液相色譜的模塊，啟動工作站并初始化儀器。2. 儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測量項目，設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù)：流動相組成=甲醇:水(70:30) ，流速=1.0 mL/min ，柱壓=200 kPa。3. 運(yùn)行程序，清洗色譜柱，直至基線平穩(wěn)，然后進(jìn)樣，進(jìn)行測定。4. 測定結(jié)束后，依次用純水、100%甲醇洗滌20分鐘，退

56、出主程序，關(guān)閉計算機(jī)。,1. 溶液的配制：（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用流動相為溶劑，標(biāo)樣儲備液為原液配制濃度為0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：待儀器穩(wěn)定后，依次進(jìn)樣20μL已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄色譜圖1—5及保留時間tR。 3.樣品分析：注入20μL未知溶液，記錄色譜圖6及各組分保留時間tR。,實(shí)驗(yàn)步驟,,檢查流動相是否充足。超純水

57、要天天換，容易滋生細(xì)菌。待儀器穩(wěn)定后，再進(jìn)樣。進(jìn)樣器要充分洗滌。儀器若長時間不用，用注射器抽洗閥門（上下兩個）中的溶液，以減少泵的磨損。在實(shí)驗(yàn)操作過程中千萬不能關(guān)閉系統(tǒng)；,注意事項和問題,電池電動勢： E電=ESCE - E膜 - EAgCl,Ag而其中 E膜=E外- E內(nèi) =k+0.059lgαH所以 E電 =k′- 0.05

58、9lgαH =k′+ 0.059pH,pH計測定溶液的pH值,實(shí)驗(yàn)儀器標(biāo)本觀摩,我們學(xué)習(xí)和使用的儀器內(nèi)部是什么樣的？—— 眼見為實(shí)！,致知樓二層1229實(shí)驗(yàn)室,?在學(xué)習(xí)儀器分析課程時，你是否能夠理解原理圖示的儀器結(jié)構(gòu)？,?對某一種儀器的光路，你是否能想象出光束在儀器中是什么樣子的？,?對關(guān)鍵性部件，比如光柵、光電管，你的想象和實(shí)物一樣嗎？,?我們學(xué)習(xí)的儀器原型機(jī)，是怎么發(fā)展變成現(xiàn)代儀器的，它們的差別是