第4章-微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)基

1、第四章,微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)基,自學內容,營養(yǎng)、營養(yǎng)物異養(yǎng)微生物、自養(yǎng)微生物、雙功能營養(yǎng)物氨基酸自養(yǎng)型生物、異養(yǎng)型生物能源及能源譜生長因子，生長因子自養(yǎng)型微生物，生長因子異養(yǎng)型微生物，生長因子過量合成型微生物無機鹽及其作用,營養(yǎng)物（營養(yǎng)作用，nutrient）,指具有營養(yǎng)功能的物質在微生物學中，常常還包括光能這種非物質形式的能源在內。微生物的營養(yǎng)物可為它們正常生命提供結構物質、能量、代謝調節(jié)物質和良好的生理環(huán)境。,營養(yǎng)（營養(yǎng)

2、作用，nutrition）,是指生物體從外部環(huán)境攝取其生命活動所必需的能量和物質，以滿足其生長和繁殖需要的一種生理功能。營養(yǎng)物質作用參與細胞組成構成酶的活性成分與物質運輸系統(tǒng)提供機體進行各種生理活動能量,第一節(jié) 微生物的營養(yǎng)素,微生物的培養(yǎng)基配方猶如菜譜，新的種類是層出不窮的。不論從元素水平還是從營養(yǎng)要素的水平來看，微生物的營養(yǎng)與攝食型的動物（包括人類）和光合自養(yǎng)型的植物非常相似，它們之間存在著“營養(yǎng)上的統(tǒng)一性”微生物有六種

3、營養(yǎng)要素，即碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水。,一、微生物的化學組成,微生物與動植物相同，都需要20種元素，C H O N P S 六種元素為主，占細菌干重97％，還包括：K Na Mg Ca Fe Mn Cu Co Zn 分類：碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽、水有機物有蛋白質、糖、脂、核酸、維生素及其降解產物與代謝產物等物質組成。水是細胞中主要成分，占干重的90％，賦予細胞的遺傳連續(xù)性、透性和生化活性。,微生物的化學組

4、成是動態(tài)的，依種類、培養(yǎng)條件、菌齡而改變；幼齡 N多微生物細胞含某種元素量多則細胞對這種元素的需要量就大，含量低則需要量少；,（一）碳源物質除水外含量最大——大量營養(yǎng)素,凡可以被M用來構成細胞物質的或代謝產物中碳素來源的營養(yǎng)物質稱碳源物質；從碳源譜的大類來看，有有機碳源與無機碳源兩大類，凡必須利用有機碳源的微生物，就是為數眾多的異養(yǎng)微生物，凡能利用無機碳源的微生物，則是自養(yǎng)微生物。微生物細胞含碳量占干重50%。,,微生物的碳源

5、譜,微生物的碳源譜雖然很廣，但對異養(yǎng)微生物來說，其最適碳源則是“C·H·O”型。其中，糖類是最廣泛利用的碳源，其次是醇類、有機酸類和脂類等。在糖類中，單糖勝于雙糖和多糖，已糖勝于戊糖，葡萄糖、果糖勝于甘露糖、半乳糖；在多糖中，淀粉明顯地優(yōu)于纖維素或幾丁質等純多糖，純多糖則優(yōu)于瓊脂等雜多糖和其他聚合物。,對異養(yǎng)微生物來說，它的碳源同時又充作能源，這時，可認為碳源是一種雙功能的營養(yǎng)物。異養(yǎng)細菌雖然必須利用各種有機

6、碳源，但不少種類尤其是生長在動物的血液、組織和腸道中的致病微生物，還需要少量二氧化碳才能正常生長，因此，在培養(yǎng)它們時，常要提供10% CO2；在其他好氧微生物生長時，如果用KOH除CO2，也往往對其生長有抑制。,不同微生物利用碳源的能力不同。 有的能廣泛地利用，如假單孢菌屬有些種可利用90種以上的碳源， 有的碳源范圍極其狹窄，如甲烷氧化菌僅能利用甲烷和甲醇。,二、氮源,凡是提供微生物生長繁殖所需要氮元素營養(yǎng)源，稱為氮源(nitroge

7、n source)。 細胞的干物質中氮含量僅次于碳和氧。 氮是組成核酸和蛋白質的重要元素， 氮對微生物的生長發(fā)育有著重要的作用。,無機氮源：N2 N+O：硝酸鹽 N+H：胺類 有機氮源：N+C+H+O：尿素、氨基酸 N+C+H+O+X：蛋白質、核酸 氨基酸自養(yǎng)型生物：自身合成 氨基酸異養(yǎng)型生物：

8、外界吸收,許多腐生性細菌、腸道菌、動植物致病菌一般都能利用銨鹽或硝酸鹽作N源，E coli、產氣桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、防線菌可利用硝酸鉀作N源，霉菌可利用硝酸鈉作N源；牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿為實驗室氮源；,能利用N2生長微生物,營非共生生活的好氧型自生固N菌；兼性厭氧型的克氏肺炎桿菌；厭氧型的巴氏固N梭菌；營共生生活的固N菌－根瘤菌；在含化合態(tài)N培養(yǎng)基時固N菌利用化合態(tài)N，無

9、時利用還原大氣中分子態(tài)N。,三、能源,能為M生命活動提供最初能量來源的營養(yǎng)物或輻射能；化學能： 有機物：碳源為能源； 無機物：不同于碳源，如 S、H2S 光能：可見光,四、無機鹽,為機體生長提供必需的金屬元素，Na K Mg Fe 及硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物；生理作用：參與酶組成，構成酶最大活性；維持細胞結構的穩(wěn)定；調節(jié)與維持細胞的滲透壓平衡；控制細胞的氧化還原電位；作為某些M生長的能源物質。,P、S、K、M

10、g、Na、Fe：10-3---10-4 Cu、Zn、Mn、Mo、Co等：10-6---10-8 K2HPO4 + MgSO4 大量使用有毒、微量元素一般不需專門添加；,磷：合成核酸、pro、核pro、磷脂與其它含p化合物的重要元素。 是許多酸，輔酶的重要組成元素。（NAD NADP、輔酶A）。 核苷酸GTP、ATP、CTP、UTP等在cell物質合成與能量傳遞和儲存過程中起重要作用。 對環(huán)境pH起調節(jié)作用（磷酸Buf

11、fer）。,硫：,是胱Aa、半胱Aa、甲硫Aa的組成元素之一，是構成Pro的主要成分。參與一些生理代謝活性物質的組成，如硫胺素、生物素、輔酶A等。硫或硫化物也能作為某些M的能源物質。,鎂：,構成某些酶的活性成分，如已糖磷酸化酶、異檸檬酸脫H酶或使酶活性到最大；是光合M的光合色素——葉綠素或細菌葉綠素的組成元素，在光能轉換上起重要作用。在M cell中某些cell結構如核糖體、cell膜等的穩(wěn)定上起重要作用。G＋需要量>G

12、-，缺鎂，核糖體與cell膜穩(wěn)定性降低，影響機體正常生長。,鐵,是M cell內H2O2酶，過氧化物酶、cell色素與cell色素氧化酶的組成元素；是某些鐵細菌生長的能源物質，因此缺Fe使機體內的某些代謝活性降低或喪失，細菌得不到能量；Ecoli在缺Fe培養(yǎng)基中不能合成足夠的甲酸脫H酶，因而在發(fā)酵葡萄糖時不產生氣體；白喉桿菌在Fe充足時，不形成白喉毒素，在Fe不足時，能合成大量白喉毒素，通過控制Fe濃度，控制產毒素能力。,微量元素

13、M生長還需要一些元素，需要量少，如無特殊原因不額外加，過量有毒害作用。,五、生長因子,微生物生長所必須、需要量很小、一般不能用簡單的碳、氮源自行合成的有機物。 維生素、氨基酸 、堿基、甾醇等；生長因子自養(yǎng)型微生物：不需要 生長因子異養(yǎng)型微生物：吸收生長因子過量合成型微生物,功能,（1）構成細胞的組成成分。（2）作為酶的組成成分。（3）維持酶的活性。（4）調節(jié)細胞滲透壓，氫離子濃度和氧化還原電位。（5）作為某些自養(yǎng)菌的能源

14、。,六、水,(1) 直接參與一些反應。如藍細菌 (2) 作為機體內一系列生理生化反應的介質。 (3) 營養(yǎng)物質的吸收、代謝產物的排泄都需通過水(4) 由于水的比熱高，又是良好的熱導體，能有效吸收代謝中放出的熱并將吸收的熱迅速散發(fā)出去，避免導致胞內溫度陡然升高——控制胞內溫度;,,,水在細胞中有兩種存在形式：結合水和游離水。 結合水，很難加以利用。 游離水（或稱非結合水）則可以被微生物利用。,不同生物及不同細胞結構中

15、游離水的含量有較大的差別：,人體 平均60% 海蜇 ?96% 霉菌孢子 ?39% 孢子 細菌芽孢 皮層 ?70% 微生物 核心 30% 營養(yǎng)體 細菌 ?80%

16、 酵母 ?75% 霉菌 ?85%,,,,第二節(jié) 微生物的營養(yǎng)類型,微生物的營養(yǎng)類型,能源：光能營養(yǎng)型、化能營養(yǎng)型 供氫體：無機營養(yǎng)型、有機營養(yǎng)型 碳源：自養(yǎng)型、異養(yǎng)型 氨基酸：氨基酸自養(yǎng)型、氨基酸異養(yǎng)型 生長因子：原養(yǎng)型、缺陷型 獲取有機物：腐生、寄生,不同營養(yǎng)類型之間界限并非絕對紫色非硫細菌 沒有有機物 同化CO2，有機物存在，利用有機物光照厭氧，

17、利用光，黑暗有氧，依靠有機物產生的化學能,第三節(jié) 營養(yǎng)物質進入細胞的方式,一、單純擴散（O2、CO2、乙醇等） 特點：高濃度-----------低濃度 運送速度慢 無特異載體 運送動力：濃度差 運送終點：內外濃度相等 運送前后溶質分子：結構不變,二、促進擴散（氨基酸、維生素等）,特點：高濃度

18、 低濃度 運送速度快 有特異載體 運送動力：濃度差 運送終點：內外濃度相等 運送前后溶質分子：結構不變,,,,,促進擴散,三、主動運送（無機離子、有機離子等）,特點：低濃度 高濃度 運送速度快 有特異載體 運送動力：消耗能量ATP

19、 運送終點：內外濃度高得多 運送前后溶質分子：結構不變,,,主動運送,四、基團移位（各種糖類、核苷酸等）,特點：低濃度 高濃度 運送速度快 有特異載體 運送動力：消耗能量ATP 運送終點：內外濃度高得多 運送前后溶質分子：結構改變,,大腸桿菌的磷酸轉移酶系統(tǒng)轉運葡萄糖 酶Ⅰ：非特異

20、性 酶Ⅱ：特異性載體 HPr：熱穩(wěn)定性蛋白（分子量低、可溶性） PEP：磷酸烯醇式丙酮酸,熱穩(wěn)蛋白的激活 酶Ⅰ PEP + HPr HPr~磷酸 + 丙酮酸 糖被磷酸化運入膜內膜外環(huán)境中的G先與膜外表面的底物特異蛋白酶IIc結合糖分子被磷酸集團激活

21、 酶Ⅱ（IIa IIb） HPr~磷酸 + 糖 糖~磷酸 + HPr (在膜上) 通過酶IIc再把這一磷酸糖釋放到細胞質中,,,,,,,基團移位,甘露醇,第四節(jié) 培養(yǎng)基,培養(yǎng)基:人工配制的、適合微生物生長繁殖或產生代謝產物用的混合營養(yǎng)基質。許多微生物能夠在人工培養(yǎng)基上

22、生長；,一、選用和設計培養(yǎng)基的原則和方法,根據不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基；（一）4個原則 1、目的明確 2、營養(yǎng)協調 3、理化適宜 4、經濟節(jié)約,1、目的明確 培養(yǎng)何菌？自養(yǎng)菌？異養(yǎng)菌？種子菌？發(fā)酵菌？實驗用？生產用？ 收獲何物？收獲菌體？收獲產物？產物成分含氮如何？,2、營養(yǎng)協調 基本遵循10倍遞減關系 注重C/N比 H20 （10-1）> C （10-2）> N（10-3）

23、> （P、S） （10-4） > K、Mg （10-5） >生長因子（10-6）真菌C/N高，細菌C/N低,,3、理化適宜 （1）pH （2）滲透壓（3）氧化還原電位,（1）pH,細菌：6.5-7.5放線菌：7.5-8.5 酵母:3.8-6.0霉菌：4.0-5.8 藻類：6.0－7.0生長過程需要及時調節(jié)：緩沖液、CaCO3、NaHCO3等內源調節(jié)及外源調節(jié),（2）滲透壓與水活度,滲透壓的大小由溶液中

24、的質點數決定，等重物質，分子或離子越小，質點數越多，滲透壓越大，等滲最適于微生物生長 水活度（aw）：W可以利用的自由水或游離水的含量 同溫同壓下 aw=P/P0 0.998—0.60 P：溶液蒸汽壓，P0：純水蒸汽壓Aw過低時，微生物生長遲緩期延長，生長速度和總生長量減少,（3）氧化還原電位,還原劑釋放電子與氧化劑接受電子的趨勢 好氧菌：Eh：+0.3--+0.4 厭氧菌：Eh：+0.1以下（除氧+還原劑） 兼性

25、厭氧菌：Eh：0.1以上好氧呼吸 0.1以下厭氧發(fā)酵指示劑－刃天青：無氧呈無色，有氧顏色與溶液pH有關，中性－紫色，堿性－藍色，酸性－紅色，微含氧－粉紅色,,氧化還原電勢的調節(jié),在培養(yǎng)基中加入還原性物質能降低Eh以培養(yǎng)厭氧微生物，常用還原劑：巰基乙酸、抗壞血酸、硫化氫、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇向培養(yǎng)基中通入空氣或加氧化劑提高Eh培養(yǎng)好氧菌Eh為培養(yǎng)基中成分的綜合結果,4、經濟節(jié)約 以粗

26、代精、以廢代好、以簡代繁 以國代進等等,,,（二）4種方法生態(tài)模擬 參閱文獻 精心設計 實驗比較,培養(yǎng)基配制注意的問題,沉淀瓊脂膠體強度的破壞褐色物質的形成pH發(fā)生變化,培養(yǎng)基的滅菌,高壓蒸汽滅菌 一般培養(yǎng)基，含糖培養(yǎng)基過濾滅菌分別滅菌間歇滅菌器皿的滅菌和無菌室的消毒,二、培養(yǎng)基的種類,（一）按培養(yǎng)基成分分類 （二）按培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)分類 （三）按培養(yǎng)基對微生物的功能分類 （四）其它分類,（一）按培

27、養(yǎng)基成分分類,1、天然培養(yǎng)基 用天然成分（動、植物，微生物體）制成的培養(yǎng)基 優(yōu)點：營養(yǎng)豐富、價格低廉 缺點：成分不清楚、不穩(wěn)定 適于：菌種培養(yǎng)、發(fā)酵生產牛肉膏蛋白胨、麥芽汁培養(yǎng)基,,,,2、組合培養(yǎng)基（合成培養(yǎng)基） 高純度化學試劑配制的培養(yǎng)基 優(yōu)點：成分精確、重現性高 缺點：價格較高、微生物生長一般 適于：生理、生化、代謝、菌種鑒定研究等高氏一號培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基,3、半組合培養(yǎng)基 化學試劑

28、 + 天然成分 實際應用過程中大多數為半組合培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基,根據微生物類群來分四種菌的實驗室常用培養(yǎng)基（1） 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基------細菌牛肉膏 5g ，氯化納 5g，蛋白胨 10g，水 1000ml，pH7.2-7.4 （2） 高氏一號培養(yǎng)基-------放線菌 可溶性淀粉 20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g ，NaCl 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g

29、，水1000ml pH7.2-7.4,（3） 麥芽汁培養(yǎng)基---------酵母菌干麥粉加4倍水，在60度保溫3～4h，用碘液試驗至糖化完全為止，調糖度為100巴林，煮沸過濾，pH5-6.0 （4） 察氏培養(yǎng)基------------霉菌NaNO3 3g，FeSO4 0.01g ，K2HPO4 Ig，KCl 0.5g ，MgSO4.7H2O 0.5g，蔗糖 30g ，H2O 1000ml ，pH5--6,1．固體培養(yǎng)基：外觀呈固

30、態(tài)的培養(yǎng)基（1）天然固體培養(yǎng)基：天然固體狀基質直接制成的培養(yǎng)基。如，麩皮、米糠、稻草粉配制的真菌培養(yǎng)基；（2）非可逆性固體培養(yǎng)基：由血清凝固成或無機硅膠配制的培養(yǎng)基。適合于分離自養(yǎng)型微生物。（3）凝固培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入1-2%瓊脂或5-12%明膠作凝固劑，加熱融化，冷卻后凝固。,（二）按培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)分類,凝固劑------瓊脂的特點a) 不被微生物液化分解和利用；b) 在微生物的生長溫度范圍內能保持固

31、體狀態(tài)；c) 凝固點的溫度對微生物無害；d)  不會因培養(yǎng)基滅菌而被破壞；e)  透明度好，粘著力強； f)   配制方便、價格低。,瓊脂------其熔點96℃，凝固點40℃ 明膠-------熔點28--35℃，凝固固體培養(yǎng)基為微生物提供了一個營養(yǎng)表面，可以形成單個菌落，在微生物的分離、鑒定、計數、保藏等方面起重要作用。 （4）濾膜,2．半

32、固體培養(yǎng)基： 一般用0.2%--0.7%瓊脂作凝固劑 用作觀察細菌的運動特征、噬菌體效價、各種厭氧菌的培養(yǎng)及菌種保藏等。3．液體培養(yǎng)基： 不含任何凝固劑，它常用于大規(guī)模的工業(yè)生產及實驗室進行微生物生理代謝等研究。,4、脫水培養(yǎng)基干燥培養(yǎng)基 使用時加入適量水、滅菌即可 使用方便,1.基礎培養(yǎng)基 含有一般微生物生長所需的基本營養(yǎng)成分；也可以作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎成分2.選擇性培養(yǎng)基： 就是根據某種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)

33、需要或對某種化合物的敏感性不同而設計出來的一類培養(yǎng)基。 利用這種培養(yǎng)基可以將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。,（三）按培養(yǎng)基對微生物的功能分類,加富性選擇培養(yǎng)基-------投其所好，形成優(yōu)勢，使原先極少量的篩選對象很快在數量上接近或超過原試樣中其他占優(yōu)勢的微生物，富集和增殖。 抑制性選擇培養(yǎng)基--------抑制其它菌生長 兩者功能疊加使用，利用其對某種制菌微生物的抗性，使原試樣中敏感菌死亡纖維素培養(yǎng)基、無氮培養(yǎng)基

34、。,3.鑒別培養(yǎng)基： 可以用于鑒別某種或某一類微生物的培養(yǎng)基。 一般通過加入某些試劑，使得某種或某類微生物的菌落發(fā)生顏色變化，肉眼從近似菌落中找出目的菌落的培養(yǎng)基，便于區(qū)別。例如：伊紅美藍乳糖培養(yǎng)基 EMB， 用于飲用水、牛奶中的大腸菌群的細菌學檢驗蛋白胨 10g，乳糖 5g，蔗糖5g，K2HPO4 2g，伊紅Y 0.4g，美藍0.065g，蒸餾水1000ml，pH7.2,EMB培養(yǎng)基 伊紅 美藍------苯胺染料，

35、抑制G+菌和一些難培養(yǎng)的G－細菌。低酸下----兩種染料結合，作產酸指示劑作用，大腸桿菌分解乳糖產大量混合酸，菌表面帶H＋，菌落深紫色、菌落表面有綠色金屬光澤；其它幾種產酸力弱的腸道菌呈棕色，因此為鑒別培養(yǎng)基，也具有選擇革蘭氏陰性菌的作用。,試樣：G＋菌受抑制，獲得G-；能發(fā)酵乳糖、產酸：產酸強，菌落紫色有綠色金屬光：大腸桿菌產酸弱，菌落棕色：腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬、哈夫尼菌屬不發(fā)酵乳糖、不產酸：菌落無色透明