基礎(chǔ)分子生物學(xué)重組與修復(fù)

1、Chapter 15,RECOMBINATION AND REPAIR 重組與修復(fù),15.1 Introduction  引言,同源重組（Homologous recombination）涉及兩條攜帶同樣遺傳位點(diǎn)的染色體間的DNA序列交換。位點(diǎn)特異性重組（Site-specific recombination）發(fā)生在兩個特異序列之間。轉(zhuǎn)座（Transposition）指的是轉(zhuǎn)座子移到基因組的新位點(diǎn)。拷貝選擇（

2、Copy choice）是一種RNA病毒使用的重組。,同源重組可能發(fā)生在兩條同源DNA的任意位點(diǎn)上.,位點(diǎn)專一性重組發(fā)生在兩條特定的序列(綠色), 兩條重組DNA的其他序列則是不同源的.,位點(diǎn)專一性重組能使二聚體環(huán)狀DNA分子產(chǎn)生兩個單體環(huán)狀DNA分子.,15.2 Homologous recombination occurs between synapsed chromosomes. 聯(lián)會染色體之間的同源重組.,染色體必須聯(lián)會形成交

3、叉才能使同源染色體發(fā)生交換.減數(shù)分裂的不同階段與發(fā)生于DNA上的分子事件密切相關(guān).,重組發(fā)生在第一個減數(shù)分裂的前期. 盡管復(fù)制狀態(tài)只在末期變得可見, 但染色體的出現(xiàn)也標(biāo)志著前期的開始, 這時每條染色體含兩份拷貝(姐妹染色體), 并且任何交換事件的分子水平的相互作用僅發(fā)生在4條染色體中的兩條.,細(xì)線期,偶線期,粗線期,雙線期,終變期,15.3 Breakage and reunion involves heteroduplex DNA.

4、  斷裂與重連涉及異源雙鏈體DNA.,兩條雙鏈體DNA分子間的重組關(guān)鍵是單鏈的交換.當(dāng)雙鏈體DNA的單鏈與相對應(yīng)的另一雙鏈體中的單鏈發(fā)生置換時, 會產(chǎn)生一個分叉結(jié)構(gòu).交換產(chǎn)生異源雙鏈體DNA片段, 兩條單鏈分別來自父本和母本.,聯(lián)合分子可以通過切開相接的鏈從而形成兩條分開的雙鏈體分子.重組體是否形成取決于參與原來交換的鏈, 或另一對鏈在解離過程中是否被切開.,兩條配對雙鏈體DNA的重組包括相互的單鏈交換,分叉遷移和缺口的

5、切出.,根據(jù)鏈被切出缺口的位置, Holliday結(jié)構(gòu)的結(jié)果可產(chǎn)生親本雙鏈體或重組雙鏈體. 兩種類型的產(chǎn)物都有一段異源雙鏈體DNA.,15.4 Double-strand breaks initiate recombination.  雙鏈斷裂引發(fā)重組.,DNA(受體)雙鏈體的雙鏈斷裂引發(fā)重組.核酸外切酶作用產(chǎn)生3'單鏈末端, 它能進(jìn)一步攻擊其他(供體)雙鏈體.新合成的DNA代替被降解的物質(zhì).這產(chǎn)生一個重組的聯(lián)合

6、分子, 其中兩個DNA雙鏈體由異源雙鏈體DNA連接而成.,重組由雙鏈斷裂啟動, 然后產(chǎn)生3?單鏈末端, 其中的一個移到同源雙鏈體上.,15.8 The bacterial RecBCD system is stimulated by chi sequences.  chi位點(diǎn)激活細(xì)菌的RecBCD系統(tǒng).,RecBCD復(fù)合體有核酸酶與解旋酶的活性.它結(jié)合到DNA的chi位點(diǎn)下游, 解開雙鏈體, 從3?端到5?端降解一條鏈直到c

7、hi位點(diǎn)為止.chi位點(diǎn)引發(fā)RecD亞基的丟失以及核酸酶活性.,RecBCD核酸酶從一邊開始向chi位點(diǎn)前進(jìn), 當(dāng)它前進(jìn)時，它降解DNA；在chi位點(diǎn)，它進(jìn)行核酸酶內(nèi)切, 而后失去RecD, 并只保留解旋酶活性.,15.9 Strand-transfer proteins catalyze single-strand assimilation.  鏈轉(zhuǎn)移蛋白催化單鏈同化.,RecA與單鏈或雙鏈DNA形成微絲, 催化含3

8、9;端游離的單鏈DNA與DNA雙鏈體上的對應(yīng)區(qū)段發(fā)生置換.,在部分雙鏈體分子和完整雙鏈體DNA分子之間, RecA介導(dǎo)鏈的交換, 它產(chǎn)生了與重組中間體的結(jié)構(gòu)一樣的聯(lián)合分子.,15.10 The Ruv system resolves Holliday junctions.  Ruv系統(tǒng)解開Holliday連接點(diǎn).,Ruv復(fù)合體作用于重組接點(diǎn).RuvA識別重組接點(diǎn), 而RuvB是一個催化分叉遷移的解旋酶.RuvC切割重組接點(diǎn)

9、, 產(chǎn)生重組中間體.,15.16 Specialized recombination involves specific sites.專一性重組涉及特異位點(diǎn).,專一性重組在特異位點(diǎn)進(jìn)行, 但位點(diǎn)不一定是同源的.?噬菌體通過噬菌體位點(diǎn)和大腸桿菌染色體上att位點(diǎn)的重組整合到細(xì)菌染色體上.通過線性前噬菌體末端位點(diǎn)之間的重組使得噬菌體從細(xì)菌染色體上外切出來.?噬菌體的int編碼整合酶來催化整合反應(yīng).,通過在attB和attP之間的相互重

10、組, 噬菌體環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成線性的前噬菌體; 而通過在attL和attR之間的相互重組, 前噬菌體能被外切出來.,15.17  Site-specific recombination involves breakage and reunion.  位點(diǎn)專一性重組涉及斷裂和重連.,attB和attP產(chǎn)生7個bp交錯的切口, 末端以十字架狀連接.,attB和attP的共同核心序列的交叉切割允許十字架狀的連接, 使相互之間

11、能產(chǎn)生重組連接點(diǎn).,15.19  Lambda recombination occurs in an intasome. ?噬菌體重組發(fā)生在整合體中.,?噬菌體整合發(fā)生在一個包含宿主蛋白IHF的大復(fù)合體中.切割反應(yīng)需要Int和Xis, 并且需識別前噬菌體DNA末端作為底物.,Int和Xis結(jié)合到attP的不同位點(diǎn), 在核心區(qū)域的Int識別位點(diǎn)包括被切割位點(diǎn).,,Cre Recombinase,P1 Phage,15.20 R

12、epair systems correct damage to DNA.  修復(fù)系統(tǒng)校正DNA損傷.,修復(fù)系統(tǒng)識別與標(biāo)準(zhǔn)堿基對不一致的DNA序列.外切系統(tǒng)把DNA鏈從損傷位點(diǎn)移去, 然后替換它.重組修復(fù)系統(tǒng)利用重組來替換損傷的雙鏈體區(qū)域.所有這些系統(tǒng)在修復(fù)過程中易于引入錯誤.光激活是一種非突變性修復(fù)系統(tǒng), 特異性地作用于嘧啶二聚體.,胞嘧啶脫氨形成U-G堿基配對, 尿嘧啶將優(yōu)先從錯配堿基中去除.,復(fù)制錯誤產(chǎn)生錯配堿基對

13、, 通過代替一個堿基, 這個錯配堿基對就能被校正. 如果不能被校正, 那么突變就會存在于子代雙鏈體中.,紫外線照射在兩個相鄰胸腺嘧啶之間形成二聚體, 它抑制復(fù)制和轉(zhuǎn)錄.,堿基的甲基化扭曲了雙鏈螺旋結(jié)構(gòu), 引起復(fù)制時的錯配.,去嘌呤化將堿基從DNA中去除.,修復(fù)基因可被歸為不同的通路, 它們分別運(yùn)用不同的機(jī)制逆轉(zhuǎn)或繞過DNA損傷.,補(bǔ)充:  大腸桿菌中的堿基切除修復(fù)系統(tǒng).,利用合適的糖基化酶去除不正確的堿基, 產(chǎn)生一個無堿基位點(diǎn)

14、(AP位點(diǎn)).AP 內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)上游切割受損DNA, 這樣形成一個靠近AP位點(diǎn)的3‘-OH 端. DNA聚合酶延伸3‘-OH 端, 同時切除AP位點(diǎn).,大腸桿菌中的堿基切除修復(fù),15.21  Excision repair systems in E. coli (Nucleotide Excision Repair ). 大腸桿菌中的外切修復(fù)系統(tǒng)(核苷酸切除修復(fù)).,Uvr系統(tǒng)在距離損傷DNA兩側(cè)約12bp

15、處插入, 移去插入點(diǎn)之間的DNA序列, 并重新合成新的DNA.,外切-修復(fù)系統(tǒng)去除和替代一段含有損傷堿基的DNA.,Uvr系統(tǒng)作用的不同階段, UvrAB復(fù)合物識別損傷部位; UvrBC復(fù)合物切開一個缺口; UvrD解開標(biāo)記的區(qū)域.,15.24  Error-prone repair and mutator phenotypes. 錯誤傾向性修復(fù)和增變體表型.,若損傷DNA未被修復(fù)會導(dǎo)致DNA聚合酶III在復(fù)制過程中停止.D

16、NA聚合酶V或DNA聚合酶IV能夠合成一條損傷鏈的補(bǔ)償鏈.修復(fù)性DNA聚合酶合成的DNA常常含有錯誤序列.,15.25 Controlling the direction of mismatch repair.  控制錯配修復(fù)的方向.,mut基因編碼處理錯配堿基對的錯配修復(fù)系統(tǒng).選擇哪一條鏈進(jìn)行修復(fù)是有傾向性的.在半甲基化的 處, 缺少甲基化的鏈常常被置換.這用于切除新合成鏈中的錯誤.,GATC

17、CTAG,在復(fù)制后, GATC序列是Dam甲基化酶的靶標(biāo), 非甲基化鏈?zhǔn)清e配堿基修復(fù)的靶標(biāo).,MutS識別錯配堿基, 并轉(zhuǎn)位到GATC序列; 在GATC序列, MutH切割未甲基化的鏈, 最后, 核酸內(nèi)切酶切除GATC位點(diǎn)到錯配位點(diǎn)間的片段.,15.26 Recombination-repair systems in E. coli. 大腸桿菌中的重組修復(fù)系統(tǒng).,大腸桿菌的rec基因編碼主要的重組修復(fù)系統(tǒng).復(fù)制在新合成鏈中留下一個對

18、應(yīng)于損傷序列的缺口時, 此系統(tǒng)起作用.另一條雙鏈體中的單鏈被用來置換缺口.然后損傷的序列被切除并重新合成.,如果此鏈有無法修補(bǔ)的損傷位點(diǎn), 大腸桿菌修補(bǔ)系統(tǒng)將會用正常的DNA鏈替代留在新合成鏈中的間隙.,15.28 RecA triggers the SOS system.   RecA引發(fā)SOS系統(tǒng).,DNA損傷導(dǎo)致RecA引發(fā)SOS應(yīng)答途徑, 這條途徑由許多編碼修復(fù)酶的基因組成.RecA能激活LexA的自我切割活性

19、.LexA抑制SOS系統(tǒng); 它的自我切割激活那些基因.,LexA蛋白能抑制許多基因的表達(dá), 包括起修復(fù)作用的recA和lexA, RecA的激活引起LexA的蛋白水解, 從而誘導(dǎo)所有的這些基因.,15.30 A common system repairs double-strand breaks.   一種常見的修復(fù)斷裂雙鏈的系統(tǒng).,NHEJ途徑可以連接雙鏈體DNA的鈍性末端.NHEJ途徑的突變導(dǎo)致人類疾病.,非同源末端連