mtt配制、原理、操作步驟、結(jié)果分析、注意事項(xiàng)

1、MTT實(shí)驗(yàn)操作步驟實(shí)驗(yàn)操作步驟1.收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至5104ml。（MG63DOXSF86細(xì)胞都是這個(gè)濃度）。2.細(xì)胞懸液吹打均勻后，用排槍接種到96孔板，每孔100ul(即5000個(gè)細(xì)胞)。3.種完細(xì)胞后6—24小時(shí)后，等其完全貼壁，將排槍調(diào)至130ul，將上清液培養(yǎng)基吸出（吸取過程中要?jiǎng)幼饕p，沿孔壁至每孔的左下角，槍尖不要在底面滑動(dòng)，防止損傷細(xì)胞）。4.用完全培養(yǎng)基將藥物按梯度配制好，每孔加入含藥

2、培養(yǎng)基150ul，孵育72小時(shí)（每個(gè)藥物做3個(gè)復(fù)孔）。5.72h后，將排槍調(diào)至180ul，將上清液培養(yǎng)基吸出，每孔加入50ul0.5mgml的MTT溶液，孵箱內(nèi)孵育4小時(shí)。（MTT溶液配制方法：MTT粉末先用PBS緩沖液配制成5mgml，超聲溶解后過0.22ul微孔濾膜除菌，4℃保存，此為MTT母液，母液四度可保存一月，配制時(shí)注意不要配太多?。?shí)驗(yàn)中MTT溶液為MTT母液10倍稀釋與不含血清培養(yǎng)基，e.g.如果需要10mlMTT溶液，取

3、1ml母液加9ml不含血清培養(yǎng)基）6.4h后，排槍調(diào)至80ul，將上清MTT溶液吸出（注意不要損失底面的紫色結(jié)晶），每孔加入150ulDMSO溶液，孵箱內(nèi)孵育1小時(shí)，以便結(jié)晶完全溶解。7.讀板器讀板（讀板前注意觀察紫色結(jié)晶是否完全溶解）8.讀板設(shè)置為570nm跟650nm兩波長(zhǎng)讀數(shù)，輸出OD值為570nm處讀數(shù)650nm處讀數(shù)。e.g.cellplate:controlcontrol0.10.20.40.81.63.26.412.8ug

4、mlcontrolcontrolDRUG1controlcontrolcontrolcontrolcontrolcontrolDRUG2controlcontrolResult:0.07720.24760.24440.23940.19910.17840.16170.13760.10280.09660.08420.07750.07440.31080.29420.26830.23870.22390.18910.17370.12890.106

5、30.09660.07650.0760.31110.31850.28990.24720.21750.20480.16280.13670.11110.0940.07880.07240.31040.3190.27470.25130.22270.21440.16580.14390.11780.09380.07860.07850.31520.30390.28320.26110.23030.1930.16780.15060.10820.07970

6、.07540.07230.28830.3140.28640.25910.22830.20230.15650.1510.1230.09810.08080.07410.26440.29280.28480.27170.20650.18520.15660.14410.12040.08990.08340.0790.28460.26470.27430.22550.19530.17590.16440.14050.10830.08440.0832該溶解

7、液因含有SDS，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。五、五、MTTMTT法實(shí)驗(yàn)步驟法實(shí)驗(yàn)步驟1:胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至5104ml。細(xì)胞數(shù)量因?qū)嶒?yàn)?zāi)康牟煌瑧?yīng)做相應(yīng)調(diào)整，如一般細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔2000個(gè)就可以（相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為2104ml），細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔5000—10000個(gè)（相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為5104ml）。此外，還應(yīng)根據(jù)

8、細(xì)胞本身特性，如生長(zhǎng)快慢，來決定細(xì)胞數(shù)量。比如：生長(zhǎng)較快的細(xì)胞密度可略小。2將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕吹打混勻，每孔加入100ul這樣待測(cè)細(xì)胞的密度為5000孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻，如每加注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻，如每加6個(gè)孔就混勻個(gè)孔就混勻一次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間完全相同，這對(duì)于一次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間

9、完全相同，這對(duì)于MTT的結(jié)果至關(guān)重要。的結(jié)果至關(guān)重要。3.將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）加入濃度梯度的藥物原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般57個(gè)梯度每孔100ul設(shè)3個(gè)復(fù)孔，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況。對(duì)于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認(rèn)為應(yīng)盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好管中將不同濃度的藥物配好，

10、然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準(zhǔn)確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應(yīng)該吸完一部分后立即加樣，避免由于96孔板干燥引起細(xì)胞死亡。4.5%CO2，37℃孵育1648小時(shí)小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為一典型的藥物梯度為細(xì)胞的毒性作用。5.每孔加入10ulMTT溶液（5mgml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h