第八章-寄生蟲疫苗

1、第八章 基因工程寄生蟲疫苗 Parasite Vaccine By Gene Engineering第一節(jié) 概 述 （Section I Outline）人體寄生蟲與人類共存的歷史可追溯到遠(yuǎn)古，在漫長的歲月里寄生蟲和宿主的關(guān)系經(jīng)歷了“史前期”，“形成期”和“確定期”。據(jù)WHO統(tǒng)計，目前大約1/4世界人口受到五大寄生蟲感染（瘧疾、血吸蟲、利什曼原蟲、絲蟲、錐蟲）要全面控制寄生蟲病的流行，所面臨的仍是一條漫

2、長而艱辛之路。,寄生蟲與宿主的關(guān)系保持平衡是在長期進化過程中逐步形成的。 經(jīng)過自然選擇宿主逐漸形成有效的免疫反應(yīng)以防范寄生蟲的毒害作用。通過高度自然選擇，一些種群的寄生蟲和宿主關(guān)系不相適應(yīng)，難以平衡逐步消失。而另一些種群在進化過程中獲得某些保護自己而不被宿主清除的功能，即所謂寄生蟲的免疫逃避機制。,一、對寄生蟲疫苗研究成功的關(guān)鍵（key of success ）1、包括選擇免疫應(yīng)答難以作用的寄生部位； 2、寄生蟲在宿主體內(nèi)不同發(fā)育

3、階段表現(xiàn)抗原特異性改變，從而使獲得性免疫力有嚴(yán)格的階段（或期）特異性。各階段（期）因其不同的表面抗原而避開了前一階段引起的宿主免疫效應(yīng)機制的傷害。寄生蟲表面抗原變異在錐蟲，瘧原蟲，巴貝蟲等致病性原蟲表現(xiàn)更為明顯。,3、寄生蟲在抗原變異，抗原摹擬和寄生蟲攝入宿主DNA和獲得宿主蛋白或以宿主抗原偽裝自己方面也表現(xiàn)出非常復(fù)雜而有效的免疫逃避機制。但是，任何一種寄生蟲在宿主體內(nèi)長期存活的免疫逃避機制均未能完全搞清楚。仍是一個值得深入研究和探討的

4、課題。,,二、寄生蟲疫苗的分類（category of parasite vaccine）寄生蟲疫苗研究始于1903年，至今洽好100年?？煞诸悶椋?①帶低毒活野生型疫苗（自然界中分離的）；②致弱病原疫苗（減毒活疫苗）；③滅活或死病原疫苗；④亞單位疫苗（包括抽提物或代謝產(chǎn)物）；⑤合成的或重組的抗原疫苗；⑥抗獨特型Ab疫苗；⑦DNA疫苗。,,三、問題（questions）迄今仍無公認(rèn)的寄生蟲病疫苗，究其原因：（1）多數(shù)

5、寄生蟲為多細(xì)胞生物，寄生蟲抗原成分非常復(fù)雜，很難找準(zhǔn)特定保護性抗原，保護性免疫應(yīng)答機制不清。（2）寄生蟲抗原免疫所誘導(dǎo)的大都為部分保護性免疫力（一般為30%~70%）。（3）寄生蟲形成種種逃避宿主免疫應(yīng)答的辦法，其機制尚待闡明。（4）寄生蟲一般引起慢性長期感染，病期因寄生蟲生活史中形態(tài)上不同，常存在數(shù)階段（期）。,第二節(jié) 基因工程寄生蟲疫苗的研究現(xiàn)狀（Research status of parasite vaccine by

6、 gene engineering）一、瘧疾疫苗(maria vaccine)世界上每年3-5億人口感染人瘧，1.5-3百萬人死于瘧疾。大多數(shù)嚴(yán)重發(fā)病和死亡發(fā)生在兒童和孕婦，主要是惡性瘧（由惡性瘧原蟲感染引起）。,(一)瘧疾及瘧原蟲,瘧疾（Malaria），又名打擺子，經(jīng)按蚊叮咬而感染瘧原蟲所引起的蟲媒傳染病。,9,全球瘧疾疫情分布圖,全球人口的35%(約23.7億人)存在患瘧疾的風(fēng)險。而這一數(shù)據(jù)比起以往有所下降。研究人員還指出，目

7、前全球有大約10億人口居住在瘧疾高風(fēng)險地區(qū)，而非洲以外的感染率低于5%，撒哈拉以南的非洲地區(qū)是目前瘧疾感染最嚴(yán)重的地方。,10,瘧疾的危害,瘧疾仍然是當(dāng)今人類的最大殺手之一， 每年瘧疾發(fā)病人數(shù)為3～5億，因惡性瘧引起死亡超過100萬。,,11,瘧疾的主要癥狀,周期性寒戰(zhàn)發(fā)熱頭痛出汗貧血脾腫大,12,間日瘧原蟲生活史與形態(tài),人（脊椎動物宿主）,蚊（媒介宿主）,,,肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)育,紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育,胃內(nèi)配子生殖,胃壁孢子生殖,間

8、日瘧原蟲生活史與形態(tài),人體內(nèi)發(fā)育階段紅細(xì)胞外期（肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)育）,TS子孢子（蚊） BS,,,,紅外期裂殖體,休眠子,,紅外期裂殖子,,子孢子 紅外期裂殖體 裂殖子（蚊） （肝細(xì)胞）,,,,,,間日瘧原蟲生活史與形態(tài),人體內(nèi)發(fā)育階段紅細(xì)胞內(nèi)期（紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育）,紅外期裂殖子侵入紅細(xì)胞進行無性的裂體增殖循環(huán)和有性體形成 環(huán)狀體 (ring form) 大滋養(yǎng)體 (t

9、rophozoite) 裂殖體 (schizont) 紅內(nèi)期裂殖子 (merozoite) 配子體(雌、雄) (gametocyte),,間日瘧原蟲生活史與形態(tài),蚊體內(nèi)發(fā)育階段配子生殖(胃腔內(nèi))孢子生殖(胃壁上),雄配子體,雌配子體,雄配子,雌配子,合子,,,,,合子,動合子,囊合子(卵囊),子孢子,子孢子 (唾腺),,,,,,,瘧原蟲的生活史 （圖）,雌雄配子體,雌雄配子,動合子

10、 合子,,,,囊合子,子孢子母細(xì)胞,感染性子孢子,,,,,蚊體內(nèi),人體內(nèi),遲發(fā)性,速發(fā)性,,復(fù)發(fā),,急性發(fā)作,預(yù) 防,,2005年6月30日，美國總統(tǒng)布什說：“瘧疾（malaria）問題是非常悲劇性的，因為該疾病本身是高度可治、可防的。,,蓋茨向瘧疾開戰(zhàn),控制傳染源 切斷傳染途徑 保護易感人群,,1億美元 研制幾種抗瘧疾新藥5070萬美元 對殺蟲劑和滅殺蚊子的手段進行改進

11、1.076億美元：葛蘭素史克公司，用于研制一種抗瘧疾疫苗，最早2010年上市,蓋茨基金會2006年12月12日宣布，將再提供8350萬美元用于瘧疾的防治。世界銀行發(fā)起一項全球抗擊瘧疾計劃，準(zhǔn)備動用5億至10億美元資金幫助非洲國家抗擊瘧疾。,（二）瘧疾疫苗的分類,1.抗紅前期原蟲疫苗 紅前期瘧疾疫苗又稱抗感染疫苗，主要針對瘧原蟲子孢子或肝內(nèi)期瘧原蟲，紅前期疫苗通過誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體，來阻止子孢子入侵肝細(xì)胞或誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特

12、異性識別感染肝細(xì)胞的 T細(xì)胞，來殺死感染肝細(xì)胞或干擾瘧原蟲在肝細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育增殖，阻止其釋放出感染性裂殖子，從而達(dá)到抗感染的效果?？辜t前期原蟲疫苗達(dá)到100%的保護率才能真正達(dá)到保護效果, 因為只要有單個子孢子逃逸就可能引起機體的感染。,位于子孢子表面的環(huán)子孢子蛋白(circumsporozoite protein，CSP) 和血凝素相關(guān)匿名蛋白(thrombospondin related anonymous protein，TRAP)

13、 是針對該期原蟲的2個重要的疫苗候選抗原。目前研究較為深入的紅前期疫苗是GSK（GlaxoSmithKline，GSK）生物公司和美國陸軍醫(yī)學(xué)研究院合作開發(fā)的RTS,S ASO1/AS02疫苗。RTS，S疫苗是全球第一種早期療效顯著 ，它由 2 部分組成 ,即 CSP的 19 個 NANP重復(fù)序列及其 C未端序列與乙肝表面抗原融合而成,2 抗紅內(nèi)期原蟲疫苗 紅內(nèi)期瘧疾疫苗又稱抗病疫苗，其機制一般是阻斷裂殖體入侵紅細(xì)胞或避免感染

14、紅細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞。裂殖子表面蛋白和頂端復(fù)合體抗原成為疫苗研究的焦點，多種抗原被作為候選疫苗進行研究。目前有些疫苗已進人臨床試驗并取得階段性成果，單一抗原疫苗MSP-1、AMA—l、GLURP、SERA、ISA720及多抗原疫苗GMZ2、PfCP-2.9/ISA720,3 傳播阻斷性疫苗 通過阻止瘧原蟲在蚊蟲體內(nèi)的有性增殖而達(dá)到阻斷瘧疾傳播的目的，在這個過程中，雖然不能使個體免于瘧疾感染，也不能減輕癥狀，但能阻斷蚊蟲將瘧原

15、蟲從一個宿主傳播至另一個宿主 ，傳播阻斷性疫苗候選抗原主要表達(dá)于蚊蟲階段瘧原蟲表面 ，是當(dāng)前瘧疾疫苗研究的熱點。雌雄配子、合子和動合子所表達(dá)的表面蛋白是研制傳播阻斷性疫苗的重要靶抗原。,（三）瘧疾疫苗研制的3個階段,1.第一階段是減毒疫苗2.第二階段是亞單位疫苗3.第三階段是基因疫苗,（四）瘧疾基因疫苗,1.孢子體表面蛋白2基因疫苗ssP22.環(huán)子孢子蛋白基因疫苗CSP（體液免疫）3.瘧原蟲蛋白17基因疫苗HEP17(

16、肝細(xì)胞空泡膜，紅細(xì)胞膜)（CTL反應(yīng)）4.HEP17/CSP聯(lián)合基因疫苗,5.裂殖子主要表面蛋白基因疫苗AWA1、 AWA2、Pf55/RESAMSP16.有性期抗原基因疫苗Pfs230、 48/45、27、25、28,瘧疾疫苗研制所面臨的困難和挑戰(zhàn),(1) 缺乏保護作用強的候選抗原。盡管在過去25年中已鑒定了約40 個疫苗候選抗原, 但能產(chǎn)生強而持久保護性免疫力的抗原仍十分有限; (2)缺乏對瘧疾保護性免疫機制的了解, 瘧

17、原蟲生活史復(fù)雜、抗原具有期特異性并存在高度變異、瘧原蟲具有多種入侵途徑和逃避宿主免疫攻擊的機制;(3) 缺乏有效的動物模型。由于瘧原蟲抗原序列存在種間差異, 因此無法用動物瘧原蟲模型來評價人體瘧疾疫苗; (4) 缺乏持久的免疫力和難以產(chǎn)生足夠高水平的抗體。,綠水青山枉自多華佗無奈小蟲何千村薜荔人遺矢萬戶蕭疏鬼唱歌,送瘟神 毛澤東,（一）血吸蟲病裂體吸蟲,◆血吸蟲由于寄生在人體的血管內(nèi)而得名；它引起的血吸蟲病俗稱大肚

18、子?。?◆血吸蟲對人類的危害 1.分布廣 2.后果嚴(yán)重,二、血吸蟲疫苗,全球血吸蟲分布圖,分布,后果嚴(yán)重,寄生于人體的血吸蟲（6種）埃及血吸蟲 （Schistosoma haematobium） 1851曼氏血吸蟲 （Schistosoma mansoni） 1902日本血吸蟲 （Schistosoma japonicum） 1903間插血吸蟲 （Schistosoma inter

19、calatum） 1934湄公血吸蟲 （Schistosoma mekongi） 1978馬來血吸蟲 （Schistosoma malayensis） 1988,日本血吸蟲Schistosoma japonicum, S.j,成蟲主要寄生于腸系膜下靜脈，致病以蟲卵為主，可引起嚴(yán)重的血吸蟲病。,血吸蟲的主要特點,成蟲似線蟲，圓柱形；雌雄異體，但常合抱成蟲在血管內(nèi)（門脈系統(tǒng)）寄生，蟲卵從糞或

20、尿中排出生活史中無雷蚴和囊蚴階段尾蚴為感染期，經(jīng)皮膚感染僅有一個中間宿主：釘螺蟲卵無蓋，蟲卵是主要致病因素，危害嚴(yán)重,日本血吸蟲?生活史?簡圖,,人體內(nèi)階段,,人體外階段,日本血吸蟲?生活史?宿主,?中間宿主,釘螺是血吸蟲的唯一中間宿主。,日本血吸蟲?生活史?宿主,?中間宿主,?保蟲宿主,牛、羊、豬、狗、鼠等30多種哺乳動物。,?終宿主,水牛,1.感染條件：,接觸“疫水”,日本血吸蟲?生活史?尾蚴感染,2.感染方式：,尾蚴主動鉆

21、入皮膚,尾蚴性皮炎,日本血吸蟲?生活史?尾蚴感染,1.感染條件：,日本血吸蟲?致病性,尾蚴童蟲成蟲蟲卵,致病機理*,（分泌物） 尾蚴性皮炎,（機械性損傷） 肺炎,（奪取營養(yǎng)） 營養(yǎng)不良（機械性刺激） 血管內(nèi)膜炎,,（蟲卵肉芽腫） 肝、腸纖維化,,,,CAg,（形成CIC） 血吸蟲病腎病、關(guān)節(jié)炎,,*,,①,肝.腸纖維化,日本血吸蟲?致病性,蟲卵結(jié)節(jié)阻塞竇前靜脈,回心血流受阻,

22、門脈高壓,腹水,②,,,,大肚子病,,1.蟲源性疫苗 死疫苗/減毒活疫苗2.基因工程疫苗3.DNA疫苗4.合成多肽抗原疫苗5.抗獨特型抗體疫苗Ab1 Ab2 抗Ab2 cocktail,（二）.血吸蟲疫苗分類,,,WHO/TDR選擇的6種血吸蟲病侯選疫苗抗原： ?谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶 （GST） ?副肌球蛋白 （Sm97） ?照射減毒抗原5 （IrV-5）

23、 ?磷酸丙糖異構(gòu)酶 （TPI） ?完整表膜蛋白 （Sm23） ?脂肪酸結(jié)合蛋白 （Sm14）,（三）.血吸蟲基因疫苗,（四）存在的問題,1.血吸蟲存在免疫逃避機制2.在動物模型和人體內(nèi)的免疫機制差異3.免疫效應(yīng)機制的選擇誘導(dǎo)4.抗原表位的鑒定5.糖基表位6.保護水平7.超敏反應(yīng)8.佐劑,? 抗原偽裝? 抗體封閉? 分泌CAg? 免疫耐受,,第三節(jié) 基因工程寄生蟲疫苗研制

24、 的前景及展望 （foreground and prospect） 特定寄生蟲疫苗的成功研制依賴于對寄生蟲感染時所引起免疫應(yīng)答的細(xì)胞和體液成分清楚的了解，以及對能誘導(dǎo)保護性應(yīng)答抗原的確定。最近在驗證和生產(chǎn)某些寄生蟲病疫苗潛在保護性抗原方面取得明顯進展，但對免疫宿主所誘導(dǎo)保護性免疫力的機制了解以及人對寄生蟲病免疫應(yīng)答特征的研究進展不大。,1

25、998年WHO/TDR與美國NIH/USAID密切協(xié)作資助血吸蟲疫苗研制計劃（SVDP）主要是促進對兩個重組曼氏血吸蟲抗原副肌球蛋白和MAP4/TPI的I期臨床試驗以及另兩個候選抗原IrV-5和MAP-3（Sm23）的DNA疫苗實驗研究，以期找到安全有效的血吸蟲疫苗。SVDP將血吸蟲疫苗候選抗原研究集中在重組抗原和DNA疫苗的評價上。,從全球看，對寄生蟲疫苗新候選抗原的發(fā)現(xiàn)，研制和臨床試驗需要各國共同協(xié)作，特別是發(fā)達(dá)國家科學(xué)家和寄生蟲病

26、流行國家的科研機構(gòu)間的協(xié)作。,對瘧疾，利什曼病和血吸蟲病，一種重組抗原的混合疫苗可能克服遺傳局限性和株種特異性。作為多抗原表位基因途徑，已用重組形式同時表達(dá)在一種致弱痘苗病毒細(xì)胞稱NY VACpf7。第一次試驗已完成。此外，核酸疫苗（含編碼不同肽基因）也有價值。有效的佐劑可能增強抗原誘導(dǎo)保護作用，對抗原提呈細(xì)胞提供上調(diào)共同刺激因子所必須的信號，以及誘導(dǎo)分子的表達(dá)從而使這些細(xì)胞達(dá)到靶組織。,用于疫苗注射的任何分子必須能誘導(dǎo)保護性免疫力，