生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 瓊脂糖凝膠的制備

1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康沫傊悄z電泳是常用的檢測核酸的方法，具有操作方便、經(jīng)濟(jì)快速等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢測核酸的方法，具有操作方便、經(jīng)濟(jì)快速等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝瓊脂糖凝膠的制備方法膠的制備方法二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠分子混合物的方法，這

2、種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場中向陽極移動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下，高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場中向陽極移動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。于分子篩效應(yīng)，即

3、分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構(gòu)型的比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。如環(huán)形分子的遷移速度不同。如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價(jià)閉合分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋分子（環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子、開環(huán)分子(ocDNA)、和線形、和線形DNA分子分子(IDNA)。這三種不同構(gòu)型分子進(jìn)行。這三種不

4、同構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時(shí)的遷移速度大小順序?yàn)殡娪緯r(shí)的遷移速度大小順序?yàn)?cccDNA＞IDNA＞ocDNA核酸分子是兩性解離分子，核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是堿基上的氨基解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只有一個(gè)磷酸解離，所以是堿基上的氨基解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只有一個(gè)磷酸解離，所以分子帶正電，在電場中向負(fù)極泳動(dòng)；而分子帶正電，在電場中向負(fù)極泳動(dòng)；而pH8.08.3時(shí)，堿基幾乎不解離，而磷酸基團(tuán)解離，所以核酸分子時(shí)，堿基幾乎不解離，而磷酸基團(tuán)解

5、離，所以核酸分子帶負(fù)電，在電場中向正極泳動(dòng)。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對泳動(dòng)速度影響不大。在中帶負(fù)電，在電場中向正極泳動(dòng)。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對泳動(dòng)速度影響不大。在中性或堿性時(shí)，單鏈性或堿性時(shí)，單鏈DNA與等長的雙鏈與等長的雙鏈DNA的泳動(dòng)率大致相同。的泳動(dòng)率大致相同。影響核酸分子泳動(dòng)率的因素主要是：影響核酸分子泳動(dòng)率的因素主要是：1、樣品的物理性狀、樣品的物理性狀即分子的大小、電荷數(shù)、顆粒形狀和空間構(gòu)型。

6、一般而言，電荷密度愈大，泳動(dòng)率越大。但是不同核酸分子的電荷密度大致相同，所以對泳動(dòng)率的影響不明顯。對線形分子來說，分子量的常用對數(shù)與泳動(dòng)率成反比，用此標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳并測定其泳動(dòng)率，然后進(jìn)行DNA分子長度（bp）的負(fù)對數(shù)——泳動(dòng)距離作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，可以用于測定未知分子的長度大小。DNA分子的空間構(gòu)型對泳動(dòng)率的影響很大，比如質(zhì)粒分子，泳動(dòng)率的大小順序?yàn)椋篶DNA＞IDNA＞ocDNA但是由于瓊脂糖濃度、電場強(qiáng)度、離子強(qiáng)度和溴化乙錠等的影響，會(huì)出

7、現(xiàn)相反的情況。2、支持物介質(zhì)、支持物介質(zhì)核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì)，瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構(gòu)成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同，是于分離不同濃度范圍的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）在NNN′四甲基乙四胺（TEMED）和過硫酸銨（AP）的催化下聚合形成長鏈，并通過交聯(lián)劑NN′亞甲雙丙烯酰胺（Bis）交叉連接而成，其網(wǎng)孔的大小由Acr與Bis的相對比例決定。瓊脂糖凝膠適合分離長度1

8、00至60的分子，而聚丙烯酰胺凝膠對于小片段（5bp500bp）的分離效果最好。加入適量的溴化乙錠至濃度為加入適量的溴化乙錠至濃度為0.5μgml。2、取有機(jī)玻璃制膠板槽，有透明膠帶沿膠槽四周封嚴(yán)，并滴加少量的膠液封好膠帶與膠槽之間的縫隙。、取有機(jī)玻璃制膠板槽，有透明膠帶沿膠槽四周封嚴(yán)，并滴加少量的膠液封好膠帶與膠槽之間的縫隙。3、水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至、水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60

9、℃左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。4、.待膠凝固后，小心拔起梳子，撕下透明膠帶，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。待膠凝固后，小心拔起梳子，撕下透明膠帶，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。5、在槽內(nèi)加入、在槽內(nèi)加入0.5TBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面五、注意事項(xiàng)1、電泳中使用的溴化乙錠（EB）為中度毒性、強(qiáng)致癌性物質(zhì)，務(wù)必小心，勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作

10、均只能在專門的電泳區(qū)域操作，戴一次性手套，并及時(shí)更換。2、預(yù)先加入EB時(shí)可能使DNA的泳動(dòng)速度下降15%左右，而且對不同構(gòu)型的DNA的影響程度不同。所以為取得較真實(shí)的電泳結(jié)果可以在電泳結(jié)束后再用0.5μgml的EB溶液浸泡染色。若膠內(nèi)或樣品內(nèi)已加EB，染色步驟可省略；若凝膠放置一段時(shí)間后才觀察，即使原來膠內(nèi)或樣品已加EB，也建議增加此步。3、加樣進(jìn)膠時(shí)不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時(shí)清除，否則，需重新制膠。4、以0.5TBE作為電