柑橘的組織培養(yǎng)

1、柑橘的組織培養(yǎng)柑橘的組織培養(yǎng)是柑橘生物技術(shù)研究的重要組成部分。上個世紀(jì)70年代以來柑橘組織培養(yǎng)技術(shù)在器官的發(fā)生、發(fā)育以及生理機制等基礎(chǔ)性問題到應(yīng)用性課題如種苗快速繁殖、無病毒苗木獲得、種質(zhì)資源離體保存等方面的研究都取得了一定的成績，尤其在品種改良、新品種育成以及遺傳轉(zhuǎn)化等相關(guān)領(lǐng)域都取得了不少成果，組織培養(yǎng)實際上是應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)進行柑橘育種的最基本也是最重要的的平臺，雖然在成果轉(zhuǎn)化和應(yīng)用方面還有需要解決的問題，但是以生物技術(shù)提升柑橘科研

2、水平，進而轉(zhuǎn)化應(yīng)用，依此加速柑橘產(chǎn)業(yè)的全面升級的目標(biāo)應(yīng)該是明確的。1成年態(tài)柑橘莖尖誘導(dǎo)和微芽嫁接成年態(tài)柑橘莖尖誘導(dǎo)指從柑橘成年樹上獲取莖段芽的莖尖作組培外植體，誘導(dǎo)成苗的技術(shù)途徑。目的是：是用再生苗的莖尖微芽嫁接達到柑橘脫毒或用于種質(zhì)資源離體保存等。尤其在遺傳轉(zhuǎn)化的研發(fā)中，一般用無菌播種的實生苗節(jié)間及上胚軸切段作為外植體雖有再生率高其耐受性好操作比較簡單是較理想的轉(zhuǎn)化受體的優(yōu)點但是這類外植體用于再生體系及轉(zhuǎn)化往往處于幼齡階段轉(zhuǎn)基因植株需

3、經(jīng)過一個相當(dāng)長的童期才能開花結(jié)果這使得對轉(zhuǎn)基因植株性狀的評價和利用周期太長，而以成年態(tài)莖段為外植體離體培養(yǎng)再生苗可以克服童期長的問題。（1）外植體消毒方法—間二消毒法成年態(tài)柑橘莖段或其它器官、組織作組培培養(yǎng)物，初代培養(yǎng)材料取自自然生長的植株都帶有各種各樣的微生物若消毒不成功就導(dǎo)會致失敗，只有對這些材料進行成功的消毒才能進行進一步的培養(yǎng)研究.材料消毒措施的力度越大滅菌效果越好但是消毒劑對植物材料又具有毒害作用特別是常用的升汞不但有殘毒而且

4、對環(huán)境的污染也比較嚴(yán)重.有研究報道，0.5cm長的柑橘縱切莖段外植體污染率較低，用70%的酒精處理30s10%的次氯酸鈉溶液處理30min放置48h后再用10%的次氯酸鈉溶液處理30min成功率最高。高溫干燥季節(jié)取材污染率較低。這種消毒方法的優(yōu)點在于:用次氯酸鈉作為消毒劑處理以后殘毒能夠自然降解避免了對環(huán)境的污染因而優(yōu)于用升汞處理；間隔2d再進行第二次滅菌處理殘存的微生物孢子萌發(fā)后被殺死不僅大大降低了污染率同時也沒有對材料造成大的損傷因

5、而成功率較高.稱之為“間二消毒法”.（2）成年態(tài)柑橘莖段再生體系①魚橙等成年態(tài)莖段培養(yǎng)技術(shù)材料與方法：供試柑橘品種是GL橙、AW橙、魚橙和霜橙四個雜交種，樹齡約15年。春、秋季在柑橘樹上選取長10～20cm且長勢一致的半木質(zhì)化枝條，去掉葉片（保留葉柄基部）和刺，用0.1%洗衣粉溶液清洗干凈，再用自來水沖洗10min，備用。在超凈工作臺上將枝條切成含腋芽約1cm的莖段外植體，并用0.1%升汞溶液消毒表面2次，2次消毒間隔時間為1d。莖段消

6、毒后進行縱切或橫切，將含腋芽的部分作外植體進行培養(yǎng)。氯濃度≥7.5%，稀釋到13濃度使用）0.2%升汞8min（加入2～3滴吐溫20）進行滅菌處理，然后將外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，10d后統(tǒng)計外植體的污染率、死亡率和萌芽率。培養(yǎng)基：誘導(dǎo)培養(yǎng)基。MTBA1.0mgLNAA0.4mgL＋3%蔗糖＋5.0gL瓊脂＋5%CW（椰子水），pH5.8。增殖培養(yǎng)基。MTBA0.25mgLNAA1.0mgLGA30.3mgL＋蔗糖5%結(jié)果觀察：滅菌效果

7、。用2.5%次氯酸鈉溶液浸泡20min、無菌水沖洗4次后，再將材料放入0.2%升汞溶液中輕輕搖晃后浸泡8min，再用無菌水沖洗4次，可將污染率控制在15%以下、死亡率小于5%、萌芽率達60%以上，其他未污染材料在培養(yǎng)基上40d后仍然保持綠色，但沒有腋芽萌發(fā)，這可能是滅菌時芽點受到了損傷。誘導(dǎo)培養(yǎng)。將經(jīng)消毒處理的化州橘紅節(jié)間莖段削取稍帶木質(zhì)部的腋芽部分，分別接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度27℃，光照強度1800～2000lx、光照12hd，

8、光暗交替培養(yǎng)2周，接種5～7d后開始逐漸有腋芽萌發(fā)，每個外植體可長出3～4個芽，而且后續(xù)生長良好。腋芽萌發(fā)后，待最高的腋芽長至2～3cm高時要及時進行分芽并移植至增殖培養(yǎng)基上，否則壯芽會抑制其他芽的進一步生長。增殖培養(yǎng)。當(dāng)幼苗長至4cm時，葉片已經(jīng)完全展開，此時要更換新的培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，在添加BA0.25mgLNAA1.0mgLGA30.3mgL時，幼苗生長良好，得到了較多茁壯且分枝多的增殖苗。在40d內(nèi)壯芽莖段可生長3～4cm，而

9、叢生芽中分離出的小芽生長較慢，但是繼續(xù)更換新的培養(yǎng)基后可逐漸長大成苗。增加蔗糖濃度對化州橘紅的增殖培養(yǎng)是非常重要，蔗糖濃度5%，增殖培養(yǎng)60d以上不更換培養(yǎng)基，幼苗仍然不出現(xiàn)落葉現(xiàn)象，生長正常。生根培養(yǎng)。未篩選出適合的培養(yǎng)基。其莖尖可用于微芽嫁接脫毒。③幾例柑橘品種的成年態(tài)莖段培養(yǎng)朋娜臍橙、紐荷爾臍橙、冰糖橙、隆園早溫州蜜柑成年樹。以半木質(zhì)化莖段的節(jié)間、節(jié)段為材料，莖段經(jīng)70%酒精消毒30s0.1%升汞消毒8min再用無菌水沖洗3～4次

10、接種于分化培養(yǎng)基上。先暗培養(yǎng)7d然后每天置于26℃光照2000lux16h下培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基:改良的MS培養(yǎng)基，即MS無機鹽100mgL肌醇0.2mgLVB11mgLVB61mgL煙酸3mgL6BA30g蔗糖。培養(yǎng)至3周后，朋娜臍橙、紐荷爾臍橙和冰糖橙田間成年樹節(jié)間接種在添加6BA的培養(yǎng)基，能分化出不定芽而隆園早溫州蜜柑不能分化出不定芽。其中，一年生紐荷爾臍橙的半木質(zhì)化節(jié)間和節(jié)段，取材相同時以3mgL6BA的分化率比1mgL6BA和5m