莠去津高效降解菌降解途徑的研究及其降解基因的克隆.pdf

1、本文首先以莠去津高效降解菌HB-5為主要研究對象，研究了HB-5降解莠去津的能力及降解途徑；另外主要從本實驗室已有菌株中又篩選到了一株能夠礦化莠去津的降解菌HB-6，研究了HB-6降解莠去津的能力及降解途徑，并對HB-6中含有的莠去津降解基因進行了克隆。
　　 主要內(nèi)容如下：
　　 1.介紹了莠去津的理化性質、國內(nèi)外應用概況，以及由于其廣泛應用所帶來的危害；對莠去津及其降解產(chǎn)物在環(huán)境介質中的各種檢測方法進行了闡述；在對前

2、人工作總結分析的基礎上，對莠去津的降解途徑、降解基因及酶系進行了全面系統(tǒng)的綜述，進而提出了作者要研究的問題。
　　 2．對實驗室已經(jīng)篩選出的莠去津高效降解菌HB-5的降解途徑及降解能力進行了研究。已經(jīng)知道HB-5能夠在24h內(nèi)將100 mg·L-1的莠去津降解完全，并且通過基因克隆發(fā)現(xiàn)，HB-5含有基因TrzN、AtzB、AtzC。將HB-5加入到以莠去津為唯一氮源的無機鹽培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)，分別在0h、12h、24h、4

3、8h、72h、96h、120h取樣，通過液相色譜及HPLC-MS對HB-5降解莠去津的降解產(chǎn)物進行分析，得到了HB-5對莠去津的降解能力及降解途徑。
　　 研究結果表明，在24h內(nèi)HB-5能夠將莠去津(100 mg·L-1)降解完全，同時生成了羥基莠去津和氰尿酸。羥基莠去津在12h的時候生成量達到最大值約為20mg/L然后隨著時間的延長逐漸消失，于此同時氰尿酸的生成量約為96 mg·L-1，然后氰尿酸的量逐漸增加至100 mg·

4、L-1左右，不再變化。用HPLC-MS測定HB-5降解莠去津后的降解產(chǎn)物，取24h和96h樣品進行液質測定，在不同時間的培養(yǎng)液中檢測到了兩種降解產(chǎn)物，它們的離子大小分別為198 (M/Z)和129 (M/Z)。通過測定莠去津降解產(chǎn)物標準樣品和莠去津的降解途徑可以得知，這兩種物質分別為羥基莠去津、氰尿酸。通過液相色譜和液相色譜質譜的聯(lián)用發(fā)現(xiàn)，HB-5能夠將莠去津最終降解至氰尿酸，而不能進行下一步的降解。
　　 3.對實驗室已有的菌

5、株HB-1、HB-3、HB-6、HB-7、HW-23、WB-1進行篩選，以氰尿酸為唯一氮源，測定它們對氰尿酸的降解能力，發(fā)現(xiàn)HB-6在24h內(nèi)對氰尿酸的降解率最高，所以選擇HB-6做下一步的實驗。另外，通過對這株細菌對莠去津的生理耐受能力及其降解能力的測定，發(fā)現(xiàn)HB-6可在莠去津含量為1000 mg·L-1平板培養(yǎng)基生長，而且在菌落的周圍形成一無色透明暈圈。
　　 4.將HB-6加入到以莠去津為唯一氮源的無機鹽培養(yǎng)基中，30℃振

6、蕩培養(yǎng)，分別在0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h取樣，通過液相色譜及HPLC-MS對HB-6降解莠去津的降解產(chǎn)物進行分析，得到了HB-6對莠去津的降解能力及降解途徑。
　　 液相測定的結果為，在24h內(nèi)HB-6能夠將莠去津(100mg·L-1)降解完全，同時生成了羥基莠去津和氰尿酸。羥基莠去津在12h的時候生成量達到最大值約為10 mg·L-1然后隨著時間的延長逐漸消失，于此同時氰尿酸也達到它的最大值約60

7、mg·L-1，然后隨著時間的推移羥基莠去津及氰尿酸逐漸被完全降解。用HPLC-MS測定HB-6降解莠去津后的降解產(chǎn)物，在不同時間的培養(yǎng)液中我們檢測到了三種降解產(chǎn)物，它們的離子大小分別為198 (M/Z)，129 (M/Z)和 60 (M/Z)。我們通過標準樣品和莠去津的降解途徑可以得知，這三種物質分別為羥基莠去津、氰尿酸和尿素。而且在144h培養(yǎng)液中無其它降解產(chǎn)物，只有尿素，這就充分說明HB-6能夠礦化莠去津。
　　 5.高效降

8、解菌對莠去津的降解特性試驗表明：培養(yǎng)溫度和pH條件對降解菌的生長及其對莠去津的降解有很大的影響，適宜降解菌生長及其對莠去津降解的溫度在20℃～40℃之間，pH在6.0～9.0之間；高濃度的莠去津對降解菌的生長及降解能力有抑制作用。
　　 6.通過菌種的形態(tài)、生理生化實驗及16SrDNA對降解菌HB-6進行了鑒定，并且與NCBI已有菌種進行了對比，結果表明HB-6為枯草芽孢桿菌。
　　 7.對莠去津高效降解菌HB-6中的莠