呋喃丹高效降解的分離篩選及其降解基因的克隆.pdf

1、從長期受呋喃丹污染的土壤中分離到一株能以呋喃丹為唯一碳源生長的細(xì)菌，根據(jù)其生理生化特征和16S rDNA（GenBank Accession No.AY702969）同源性比較，將其初步鑒定為鞘氨醇單胞菌Shingomonas sp.，命名為CFDS-1。
　　 研究了CFDS-1的生物學(xué)特性，CFDS-1最適生長溫度30℃；最適生長初始pH6.0～7.0；裝液量小于100mL/250mL時，生長良好；CFDS-1對NaCl有很

2、高的耐受性，最適生長NaCl濃度是15g·L-1；CFDS-1對葡萄糖利用較好；以有機氮為氮源生長較好；對氨芐青霉素、鏈霉素有抗性。
　　 Sphingomonas sp.CDS-1是本實驗室分離到的另一株呋喃丹高效降解菌株，為了更好地了解兩株降解菌的特性，對兩菌株降解呋喃丹的特性進行了比較，兩菌株都能降解呋喃丹生成呋喃酚，降解呋喃酚的酶被呋喃酚誘導(dǎo)后，能快速降解呋喃酚；兩菌都能很好地降解20～300mg/L的呋喃丹，對呋喃丹的

3、降解率和起始接種量呈正相關(guān)；CDS-1降解呋喃丹的最適pH值為6.0～7.0，CFDS-1降解呋喃丹的最適pH值為8.0～9.0；改變通氣量對CDS-1降解呋喃丹沒有顯著影響，而當(dāng)250ml三角瓶中裝液量為100ml時CFDS-1降解呋喃丹效果最好；CDS-1降解呋喃丹的最適溫度是30℃，CFDS-1在25℃至40℃時，都有很好的降解效果；不同的營養(yǎng)物質(zhì)對兩株菌降解呋喃丹的影響不一樣。1000mg/L的葡萄糖對于二菌株降解呋喃丹的能力略

4、有提高；土壤浸出汁可以提高CDS-1降解呋喃丹的能力，但對CFDS-1降解呋喃丹的能力基本沒有影響；加入蛋白胨和酵母膏都可以提高二菌降解呋喃丹的能力。
　　 研究了CFDS-1和CDS-1對呋喃酚的降解性能，兩株菌不僅能夠降解20mg/L的呋喃酚，對500mg/L的呋喃酚也有很好的降解效果；溫度對CDS-1和CFDS-1降解呋喃酚影響明顯，CDS-1和CFDS-1降解呋喃酚的最適降解溫度分別是30℃和35℃；CDS-1降解呋喃酚

5、的最適pH是6.0～7.0，而CFDS-1的最適pH是9.0～10.0；兩菌降解呋喃酚的速率和起始接種量基本都呈正相關(guān)；在通氣量好的情況下降解效果好；蛋白胨可以提高兩菌的降解能力，酵母粉可以提高CFDS-1的降解能力，但對CDS-1沒有影響，土壤浸出液可以提高CDS-1的降解能力，而對CFDS-1沒有影響。
　　 建立了呋喃丹水解酶（粗酶）活力的定量測定方法，研究了環(huán)境因素對其活力的影響。呋喃丹水解酶降解呋喃丹的最適反應(yīng)溫度為3

6、0℃，最適pH是6.5，該酶保存在20～30℃，pH大于6.0時能保持較高的酶活；該酶在極性的有機溶劑中很穩(wěn)定，在非極性有機溶劑中，氯仿對該酶的活性影響最大，可以抑制40％的酶活力。在供試的13種金屬離子中，當(dāng)濃度為0.2mmol·L-1至2mmol·L-1時，大多數(shù)的金屬離子可以提高呋喃丹水解酶的酶活，尤其是Cu+可以使酶活提高110％。酶的定域?qū)嶒灡砻?，CFDS-1中的呋喃丹水解酶主要存在于細(xì)胞內(nèi)，屬于胞內(nèi)酶。
　　 通過轉(zhuǎn)

7、座子插入突變法把自殺性質(zhì)粒pSC123中的轉(zhuǎn)座子插入到呋喃丹高效降解菌CDS-1中，經(jīng)過初篩和復(fù)篩獲得了六株失去降解呋喃丹功能的插入突變子。以其中一個突變子CDS-M1的基因組DNA構(gòu)建文庫，篩選含有轉(zhuǎn)座子序列的克隆，對陽性克隆中轉(zhuǎn)座子側(cè)翼進行測序，根據(jù)測序結(jié)果（共4551個堿基）設(shè)計引物，以CDS-1的總DNA作模板進行PCR，把PCR產(chǎn)物先連接到pMD18-T上，根據(jù)酶切結(jié)果分析選取兩個和載體不同方向連接的轉(zhuǎn)化子CDT1和CDT2，

8、再連接到廣宿主載體pPZP201上，得到CDZ1和CDZ2，通過三親結(jié)合的方法轉(zhuǎn)入突變子CDS-M1中，進行功能互補實驗，結(jié)果顯示突變子CDS-M1中由于轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒CDZ1后，降解功能得到了回復(fù)。表明轉(zhuǎn)座子兩側(cè)的4551個堿基序列是呋喃丹水解酶相關(guān)基因。
　　 由于CDS-1和CFDS-1在對呋喃丹和呋喃酚降解特性方面有許多不同，因此兩菌可能有不同的呋喃丹水解酶基因，通過構(gòu)建CFDS-1的基因組文庫，以對硝基苯丁酸酯作為底物

9、，篩選到一個能夠水解對硝基苯丁酸酯到對硝基苯酚的水解酶基因，該基因由1782個堿基組成，通過在Genbank中進行核酸和蛋白質(zhì)序列比對，發(fā)現(xiàn)和該蛋白序列同源性最高的序列來自Rhodococcus sp.MB1（GenBank accessionNo.AF173165）中的可卡因酯酶，它們具有34％的同源性，可以初步判斷從CFDS-1中克隆到的對硝基苯丁酸酯水解酶基因是一個全新的基因。把該基因連接到表達(dá)載體pET29a上，在E.coli

10、BL21實現(xiàn)了該基因的高效表達(dá)。從CFDS-1和E.coliBL21（DE3）-pET29a-nph的全細(xì)胞蛋白電泳圖上可以看出表達(dá)菌株中存在一條表達(dá)量高且大小和理論值相一致的條帶。nph在大腸桿菌中表達(dá)時不能降解呋喃丹，但是在CFDS-M1中表達(dá)時，具有降解呋喃丹的功能。
　　 為了研究CFDS-1在土壤中的定殖情況，首先對CFDS-1進行標(biāo)記，從CFDS-1的基因組DNA中獲得了一個帶有二個典型啟動子結(jié)構(gòu)的DNA片段，把含有

11、啟動子和gfp基因的DNA片段構(gòu)建到廣宿主載體pPZP201上，得到pPZP201-gfp，通過三親結(jié)合的方法轉(zhuǎn)入到受體菌CFDS-1，得到標(biāo)記菌株CFDS-GFP。通過轉(zhuǎn)座子再把linA基因插入到CFDS-GFP的染色體DNA中，從而構(gòu)建了雙標(biāo)記菌株CFDS-GFP-LinA，該菌株同時也是一株多功能農(nóng)藥殘留降解菌。
　　 研究了CFDS-GFP-LinA在土壤中的降解行為，結(jié)果表明CFDS-GFP-LinA能在一周內(nèi)完全降解