咔唑降解菌株的篩選及降解基因的研究.pdf

1、咔唑是一種含氮雜環(huán)芳香族化合物，是現(xiàn)代日化工業(yè)的重要原料，有著極為廣泛的應(yīng)用。咔唑具有致畸性、致突變性及潛在的致癌性。咔唑結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難以降解，具有較強(qiáng)的環(huán)境毒理效應(yīng)。因此，篩選高效咔唑降解菌株、克隆相關(guān)降解基因已成為生物修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。
　　本研究從青海油井口污泥中，富集篩選出一株能高效降解咔唑的B1菌株，其生理生化及16SrRNA基因序列分析表明，該菌株為鞘氨醇胞菌和鑒定為革蘭氏陰性菌。降解特性研究結(jié)果顯示，該菌株最適降

2、解溫度和pH分別為30℃和7.0;咔唑耐受濃度達(dá)700 mg/L;最適條件下，B1菌株在72h內(nèi)對(duì)100 mg/L咔唑的降解率可達(dá)到98％;在pH7.0～9.0范圍內(nèi)，B1菌株在96h內(nèi)對(duì)咔唑的降解率均在95％以上;該菌株在鹽濃度小于10 g/L時(shí)降解率較高;添加0.1 g/L的葡萄糖和硫酸銨能明顯提高其降解效率，達(dá)到最大降解率的時(shí)間縮短;土壤原位修復(fù)模擬實(shí)驗(yàn)表明，B1菌株與土壤中土著微生物在28 d內(nèi)對(duì)100 mg/kg的咔唑降解率約

3、為90％。
　　以分離到的B1菌株為實(shí)驗(yàn)材料，同源克隆得到咔唑降解基因簇中carAa(560 bp)、carBa(201 bp)、carBb(793 bp)和carC(392 bp)部分基因片段。不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)的B1菌株中降解基因的RT-PCR結(jié)果證明:該菌株中的咔唑降解基因簇為誘導(dǎo)表達(dá)，和多數(shù)菌株中基因表達(dá)的模式一致;qRT-PCR結(jié)果表明，在不同pH培養(yǎng)條件下，carAa基因、carBb基因、carC基因相對(duì)表達(dá)量明顯不同，在

4、pH9.0條件下，三個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平最高。
　　生物信息學(xué)分析表明，carBa和carBb兩個(gè)基因構(gòu)成carB基因時(shí)，存在8個(gè)堿基(ATGGCTGA)的重疊序列，且在CarBb亞基中發(fā)現(xiàn)CarB發(fā)揮功能的關(guān)鍵催化位點(diǎn)(His12、His53和Glu230)。以pET-32a為載體，分別構(gòu)建carB、carBa和carBb基因的表達(dá)載體，并成功誘導(dǎo)出CarB、CarBa、CarBb蛋白。酶活性反應(yīng)表明，CarB具有裂解功能，而單

5、個(gè)亞基不具有催化作用。CarB酶學(xué)性質(zhì)分析表明:CarB最適pH值和溫度分別為7.4和30℃，過(guò)高和過(guò)低的pH值（pH＜6.0或pH＞9.0）都顯著降低酶活力，高溫和低溫對(duì)酶活力也有很大的影響。不同的金屬離子對(duì)酶活也會(huì)產(chǎn)生不同的影響，其中Fe2+最能提高酶的催化活力。
　　本研究在國(guó)內(nèi)外首次獲得了鞘氨醇胞菌的咔唑降解菌株，豐富了咔唑降解菌的微生物資源;降解關(guān)鍵酶基因的克隆及酶學(xué)性質(zhì)研究，為咔唑降解、污染環(huán)境修復(fù)的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)