動物試驗前的準備和動物試驗質量監(jiān)控

1、實驗動物的選擇原則和應用,上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心中國生物醫(yī)藥技術服務中心湯家銘,初次準備做動物實驗的困惑,動物種類、品種、品系？動物性別？動物年齡？動物數量？動物的健康及生理狀態(tài)？動物的價格？動物的飼養(yǎng)成本？動物能否容易得到？動物實驗技術？,實驗動物選擇的原則是從哪里來的？,不是憑空想象出來的，而是從長期的科學研究實踐中逐步積累獲得的 ┄┄需要查閱文獻，了解前人所做的工作用什么動物做實驗是多種因素綜

2、合、權衡的結果，原則并不是僵死的 ┄┄仔細考慮動物實驗所要達到的目的、現行的實驗條件、技術及預算能否滿足要求實驗動物選擇的原則要遵循動物實驗“3R”原則,實驗動物的選擇原則,一、根據與人的相似性選擇動物（一）選用在整體上與人在結構、功能、及進化程度相似的實驗動物靈長類病原微生物的感染譜獼猴的生殖生理,猴、犬、大鼠與人在藥物代謝方面的相似性,（二）選用在某些系統(tǒng)、器官的結構、功能與人相似的實驗動物犬的血液循環(huán)、神經系

3、統(tǒng)豬的皮膚結構、心血管系統(tǒng)蛙的反射弧實驗小鼠的基因功能,（三）群體分布相似性 以群體為對象的研究課題，要選擇群體基因型、表現型分布與人相似的實驗動物。如作藥物篩選和毒性試驗時，除了應考慮人類與實驗動物群體在代謝類型上的差異外，通常以封閉群模擬自然群體基因型。,（四）疾病特點的相似性 同一種病因/病原對不同動物（包括人）的致病作用各不相同，有的差異很大，而有的卻非常相似。要尋找與人類有關疾病相似或接近的自發(fā)或誘發(fā)性疾病

4、動物模型，選擇合適的疾病動物模型進行實驗研究。,（五）與人的器官臟器大小形狀的相似性 為臨床操作打基礎的動物實驗，應選用與臨床操作較接近的動物。如心臟移植實驗、練習手術操作的動物實驗，可選擇豬作材料，因為豬心臟的形態(tài)大小與人很接近。綿羊每胎1-2個胎兒，體重與人胎兒相似，適合做圍產期胎兒手術等實驗。,二、 根據解剖和生理學特點選用實驗動物（一）解剖特點 兔的胸腔結構 兔的減壓神經 犬和兔的甲狀旁腺大鼠無膽囊 （二

5、）生理特點犬的紅綠色盲 兔對致熱原十分敏感 犬和貓對嘔吐反應敏感 豚鼠易于致敏 致敏比較：豚鼠> 兔> 犬> 小鼠> 貓> 青蛙 豚鼠對維生素C缺乏敏感家兔對射線十分敏感,三、選用標準化合格的實驗動物 野生動物：不易獲得年齡、體重一致的一批動物遺傳背景不清健康狀況有差異機體反應性不一致 標準化實驗動物排除細菌、病毒、寄生蟲和潛在疾病的影響排除環(huán)境因素的影響

6、減少實驗誤差，提高結果的科學性和正確性 能得到國際上的承認,實驗動物學的核心內容之一是實驗動物的標準化，它包括實驗動物的遺傳學控制標準、微生物學和寄生蟲學控制標準、設施環(huán)境控制標準飼料營養(yǎng)控制標準。 實驗動物標準化的意義在于在符合標準化的實驗動物及其環(huán)境條件下，所做的動物實驗無論在時間的先后上，還是在世界的不同實驗室里，其實驗結果應該具有可重復性和可對比性。,四、選擇封閉群還是近交系封閉群動物的個體具有雜合

7、性，其群體遺傳特性及反應性可保持相對穩(wěn)定。雖然群體對刺激的反應性有差異，在重復性和一致性上相對不如近交系好，但是在動物實驗中比較接近自然種屬的反應特點，因而廣泛應用于教學、預實驗、一般實驗及藥物篩選和毒理安全試驗等。近交系動物由于遺傳背景清楚，具有相同的基因型，表現型也一致，所以其對實驗刺激反應也是一致的，實驗結果正確、可靠，實驗重復性好，因而廣泛應用于遺傳學、腫瘤學和免疫學研究上。,封閉群：品系內大部分等位基因處于雜合狀態(tài)，其群體基

8、因組成占種群基因庫的一部分。,近交系：品系內幾乎所有等位基因處于純合狀態(tài)，其群體基因組成完全一致，占種群基因庫的一小部分。,近交系和封閉群動物遺傳組成的比較,同一近交系小鼠的不同個體間的等位基因都是純合的,同一封閉群的不同個體間的等位基因大都處在雜合狀態(tài)，但群體的基因頻率保持相對穩(wěn)定，接近種屬的自然狀態(tài),,,五、 動物近交品系的選擇 不同品系代表實驗動物的不同遺傳基因型，因而具有不同的生物學特性，對同一刺激的反應差異很大，

9、在選擇時必須注意。研究發(fā)現，從大多數白化實驗動物取得的數據，在推及人類時更接近于白人，而與有色人種的差異較大。C57BL小鼠對腎上腺皮質激素的敏感性比DBA及BALB/C小鼠高12倍。DBA小鼠對音響刺激非常敏感，聞電鈴聲后可出現特殊的發(fā)作性痙攣，甚至死亡，而C57BL小鼠卻根本不會出現這種反應。DBA/2及C3H小鼠對同一病毒（Newcastle病毒）的反應和DBA/1小鼠完全不同，前者引起肺炎而后者引起腦炎。A系小鼠的促性

10、腺激素含量比DBA小鼠低1.5倍。A系小鼠肝臟的β葡萄糖酸活性只有C3H小鼠的十幾分之一。A、C3H、津白Ⅱ等品系小鼠易致癌，C57、C58、津白Ⅰ等品系不易致癌，AKR、DBA/2、L615等品系易致白血病。C3H雌鼠乳腺癌自發(fā)率達90%，AKR小鼠白血病自發(fā)率達65%。C57BL/6J、Balb/c等為低發(fā)乳腺癌品系，而C3H乳腺癌發(fā)病率高達97%。用激素超排卵，C57BL屬高排卵品系，而Balb/c屬低排卵品系。,常用實驗

11、動物的壽命,六、動物年齡、體重的選擇,與人性成熟期相對應的動物年齡,應根據實驗目的來選擇適齡動物 一般實驗采用生長發(fā)育期的成年動物 成年實驗動物體重一般為： 小鼠：18-22g，大鼠：180-220g，豚鼠：350-650g，兔：2-3kg，貓：1.5-2.5kg，犬：6-15kg 長期試驗選用幼齡動物 小鼠：15-18g，大鼠：80-100g，豚鼠：150-200g，兔：1.5-1.8

12、kg，貓：1.0-1.5kg，犬：6-8kg。 老齡動物除了用作老年醫(yī)學研究外，其他學科很少應用,,,,性成熟前后生長發(fā)育最快，而體成熟后生長發(fā)育趨緩。因此用性成熟前后動物做實驗，如實驗因素對動物生長發(fā)育有影響，就能很快反映出來。,ICR小鼠,SD大鼠,注意：根據年齡判斷體重或根據體重判斷年齡要注意品種品系的不同同批動物的年齡、體重盡可能一致，相差不應超過10%。在選擇動物時，必須了解所選動物的壽命、懷孕期、哺乳期等一些指

13、標，這些指標對保證研究工作的順利進行及試驗結果的分析是非常有用的。,七、 動物性別的選擇,在實驗研究中如無特殊要求，一般宜選用雌雄各半，以避免由性別差異造成的誤差。,八、每個試驗組動物的最少數量的決定,每個試驗組動物的數量反映了該組實驗刺激的重復數。重復的主要作用是降低試驗誤差和增強代表性，提高實驗結果的精確度，保證實驗結果能在同一個體或不同個體中穩(wěn)定地重復出來。 樣本數過少，實驗處理效應不能充分顯示，數據統(tǒng)計較為困難；樣本數過多，又

14、會增加成本和實際工作中的困難。因此在進行實驗前必須確定最少的樣本例數。,最少的樣本例數可按一般估測方法確定，也可通過統(tǒng)計學方法進行測算確定。小動物一般單性別每組數量為10只大動物一般單性別每組數量為3只實驗數據的采集每組數量可多一些，形態(tài)學觀察每組數量可少一些,九、 生理狀態(tài)與健康情況動物的特殊生理狀態(tài)如懷孕、哺乳等對實驗結果影響很大。如非專門研究妊娠、哺乳等實驗，應去除特殊生理狀態(tài)的動物，以減少結果的個體差異。健康動物對刺激

15、的耐受性較患病動物高。健康動物一般發(fā)育正常、體型豐滿、被毛濃密有光澤且緊貼身體、眼睛明亮活潑、行動迅速、反應靈敏、食欲良好。外購的實驗動物，應觀察檢疫1周以上，證實其身體健康后才開始實驗。饑餓、衰竭、寒冷、炎熱情況下，動物實驗結果不穩(wěn)定。應加強飼養(yǎng)管理，控制環(huán)境條件。,十、動物的易獲得性及動物成本、飼養(yǎng)成本根據科研經費的預算，在宏觀上估計不會影響實驗結果的前提下，選擇最易獲得、最經濟、最易飼養(yǎng)管理的實驗動物進行實驗研究。開題前應做好

16、調查，以免在準備實施計劃時，才發(fā)現無法獲得所需實驗動物，而十分尷尬。應該注意的是，科研中實驗動物的選擇是上述選擇原則和科研經費預算、并結合自己實驗室硬件和軟件條件綜合考慮、權衡利弊的結果，并應充分預計選擇的實驗動物對實驗結果的影響。,第二節(jié) 部分學科實驗動物的選擇和應用,一、藥理學研究藥理學包括藥效學、一般藥理學和藥物代謝動力學等，除了小部分藥效學研究可用離體動物實驗外，一般藥理學和藥物代謝動力學研究離不開整體動物實驗研究。 大

17、部分藥效學研究要使用動物模型選擇何種動物，應參考上述的實驗動物選擇原則和實驗的具體要求進行，如對動物進行長時間多次采樣，則用小動物是不合適的。為了觀察不同種屬動物對藥物的反應性，最好同時選用兩種以上動物。,二、藥物安全性評價 藥物安全性評價是新藥在上市前所必須做的一項研究，用以了解藥物對各系統(tǒng)、器官臟器的毒性作用急性毒性試驗長期毒性試驗皮膚給藥毒性試驗 皮膚給藥急性毒性試驗 皮膚給藥長期毒性試驗

18、皮膚刺激試驗 皮膚過敏試驗遺傳毒性試驗生殖毒性試驗致癌試驗毒代動力學試驗,（一）急性毒性試驗 急性毒性試驗是通過單次或短時間內多次給藥，了解動物所產生的毒性反應極其嚴重程度，為臨床安全用藥及監(jiān)測提供參考。 急性毒性試驗一般用嚙齒類小鼠。但是申報一類新藥至少必須用兩種動物，除了嚙齒類動物外，非嚙齒類最好用比格犬。小鼠一般選用昆明種、ICR或NIH等封閉群，雌雄各半，體重18~22g（約4~5周齡），同批動物體重相差不超

19、過4g。犬用成年犬，體重8~10kg。,（二）長期毒性試驗 長期毒性試驗是通過連續(xù)反復多次給藥，觀察動物出現的毒性反應，劑量與毒性的關系，主要靶器官是什么，毒性反應的性質和程度以及毒性反應是否可逆等。 長期毒性試驗要求用兩種動物。嚙齒類首選大鼠；非嚙齒類動物當供試品為化學品時首選比格犬，當供試品為生物藥品時，要用獼猴。大鼠可選用SD或Wistar大鼠，體重要求180~220g（約6~8周齡），體重差異應不超過平均體重的20%。試驗

20、周期在3個月以上，可選用120~160g（約5~6周齡）。每組雌雄各半。 比格犬一般用6~12月齡，試驗前適應觀察2周，必要時需要接種疫苗和驅除腸蟲。 獼猴采用成年猴，3-5歲（3.5-6.5kg），試驗前適應觀察1個月，必要時需要接種疫苗和驅除腸蟲。 一般設定3個劑量組。低劑量組目的是尋找動物安全劑量范圍，為臨床劑量設計作參考。此劑量下應不出現毒性反應。中劑量組應使動物產生輕微的或中度的毒性反應。高劑量組目的是為尋找毒性靶器官、

21、毒性反應癥狀及搶救措施提供依據，也為臨床毒性及不良反應監(jiān)測提供參考，應使動物產生明顯的或嚴重的毒性反應，或個別動物死亡。,（三）皮膚給藥毒性試驗 皮膚給藥毒性試驗包括皮膚給藥急性試驗、長期毒性試驗、皮膚刺激實驗、皮膚過敏試驗。 采用的實驗動物為兔、豚鼠和大鼠，首選兔。體重要求兔2kg左右、豚鼠300g，大鼠200g，雌雄各半。給藥前24小時將動物背部脊柱兩側被毛脫去，脫毛范圍約相當于體表面積的10%，兔約150cm2

22、，豚鼠、大鼠約40cm2左右。一般一側脫毛區(qū)為給藥區(qū)，一側脫毛區(qū)為賦形劑區(qū)。,三、免疫學研究 （一）免疫學研究 在抗感染免疫、免疫生物學研究中應用最廣的是Balb/c小鼠和各種免疫缺陷動物 在自身免疫性疾病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究中，應用最廣的是新西蘭黑（NZB）以及新西蘭黑和新西蘭白的雜交F1代（NZB×NZWF1）小鼠動物模型。 在變態(tài)反應研究中，豚鼠應用得比較多。 在移植免疫研究中，移植的異體組織之所以被排斥，是

23、因為受者的免疫系統(tǒng)對供者的組織發(fā)生了免疫反應的結果。引起這種免疫反應的抗原稱為移植抗原或組織相容性抗原。在小鼠，這一抗原系統(tǒng)稱為H-2抗原系統(tǒng)，已經研究得很透徹。不同近交品系小鼠有不同的H-2型，二個相同H-2型品系小鼠間移植，可不發(fā)生排斥反應。（二）免疫學應用1．單克隆抗體的制備2．免疫血清的制備3．提供補體,四、實驗腫瘤學研究 （一）自發(fā)性腫瘤模型 在自發(fā)性腫瘤動物模型中，利用小鼠生長快、生命周期短、近交品系多、自發(fā)

24、性腫瘤與人類腫瘤發(fā)病相似等特點，可以選用具有不同的遺傳性狀特點的近交系動物進行腫瘤遺傳學和腫瘤病因學研究。 缺點:不易同時獲得大批病程相似的自發(fā)性腫瘤動物，又因這種腫瘤生長較慢，實驗周期相對較長，所以一般很少用于篩藥。 （二） 誘發(fā)性腫瘤模型 用化學致癌物、射線或病毒均可在各類動物中誘發(fā)不同類型的腫瘤。如用強化學致癌物二甲基苯蒽（DMBA）和甲基膽蒽可誘發(fā)乳癌，二苯芐芘誘發(fā)纖維肉瘤，二乙基硝胺（DEN）誘發(fā)大鼠肝癌，黃

25、曲霉素誘發(fā)大鼠肝癌等。 在使用化學劑致癌時，要注意各類化學致癌劑對動物致癌的特點 芳香胺及偶氮染料：長期反復 亞硝胺類：小劑量一次給藥 黃曲霉毒素：已知致癌劑中最強的一種,（一）移植腫瘤模型 移植腫瘤模型主要利用裸小鼠、裸大鼠及Scid小鼠。將人體腫瘤移植于免疫缺陷動物因能保持其生物學特性，用于研究人體腫瘤對藥物的敏感性。 常用的人癌組織移植的途徑 皮下移植、 腹腔移植、 原位移植 腎囊膜下移植,五、遺傳學

26、研究 在遺傳學上用來研究闡明正常遺傳及遺傳性疾病機理的動物稱為模式動物。 由于進化的原因，生命在發(fā)育過程中的基本模式具有相當的同一性，利用位于生物復雜性階梯較低級位置上的物種來研究發(fā)育共通規(guī)律是可能的。因為這些生物的細胞數量更少，分布相對單一，變化也較好觀察，而對這些生物的研究有助于人們理解生命世界的一般規(guī)律。目前在遺傳學研究上公認的模式動物有果蠅、線蟲、斑馬魚和小鼠等。,果蠅的染色體數量少，遺傳背景清楚，基因定位與表型效應的關系明

27、確，各種遺傳分析方法也較成熟，是一種經典的模式動物。 線蟲的細胞分化譜系明確，為研究細胞－細胞間相互作用和特定細胞功能提供了很好的模型。 斑馬魚通體透明，它具有體外受精、胚胎透明、體外發(fā)育、胚胎早期發(fā)育快和易于大量獲得樣品等獨有的特點，是研究器官發(fā)生的最佳材料之一。 小鼠體形小、繁殖快、生命周期短，與人同屬哺乳動物；小鼠的基因組序列已經全部闡明，基因組和人類90％同源，且生理生化和發(fā)育過程和人類相似。更為重要的是小鼠的胚胎操作技術

28、、胚胎干細胞技術以及基因改造技術已經成熟。這些優(yōu)勢凸現了小鼠在模式動物中的地位，成為建立人類遺傳性疾病的動物模型的最佳實驗材料。,六、病毒學研究實驗動物在病毒學研究中的作用病因未明病原體的分離確認發(fā)病機制的研究抗病毒藥物篩選疫苗效果鑒定診斷試劑制備等，無不需要對病毒敏感的動物模型。沒有合適的動物模型甚至成為阻礙該病研究的瓶頸。不同種屬動物對同一病毒的易感性不同，選用作病毒學研究的實驗動物，應首先考慮采用該病毒的易感動物。