生物顯微技術(shù)進展

1、,生物顯微技術(shù)進展,《組織學(xué)和細胞生物學(xué)進展》《細胞生物學(xué)專題》,,主 要 內(nèi) 容,,,,,,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),,,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,透射電子顯微鏡,掃描電子顯微鏡,光學(xué)顯微鏡,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,生物顯微技術(shù)是指在顯微鏡的觀測范圍內(nèi)用生物材料作實驗對象的專門技術(shù)。主要包括生物的組織、細胞化學(xué)，生物切片技術(shù)，顯微觀察，繪圖測量及顯微攝影技術(shù)，顯微注射、切割、挑離等操作技術(shù)，還包括顯微鏡及相關(guān)設(shè)施的使

2、用和保養(yǎng)。1665年，從英國物理學(xué)家羅伯特·虎克發(fā)現(xiàn)細胞開始，產(chǎn)生了顯微技術(shù)。羅伯特·虎克：第一位顯微技術(shù)學(xué)家。,1.生物顯微技術(shù)的概念,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,2.生物顯微技術(shù)的發(fā)展,我國偉大科學(xué)家墨子早在二千多年前就研究了放大和縮小的作用，即研究了放大的基本原理。中國人戴眼睛已有一千多年的歷史，是世界上最早的。因此可以說顯微鏡是中國人最早發(fā)明的 。公元1世紀初，在羅馬哲學(xué)家的筆記中，大自然打磨的奇妙

3、石頭被稱為“放大器”（magnifier）或“點火石”（burning glasses）。,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,荷蘭人詹森于1590 年制造了第一臺由二塊透鏡組成的復(fù)式顯微鏡。,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,1610年前后，意大利的伽利略和德國的開普勒在研究望遠鏡的同時，改變物鏡和目鏡之間的距離，得出合理的顯微鏡光路結(jié)構(gòu)，當時的光學(xué)工匠遂紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進。,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,17世紀中葉，英國的羅伯特&#

4、183;胡克（用自己制造的顯微鏡觀察軟木切片，“細胞”）和荷蘭的安東尼·馮·列文胡克（制造了只有一片凸透鏡的顯微鏡，放大了300倍）都對顯微鏡的發(fā)展作出了卓越的貢獻。,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,1695 年惠更斯設(shè)計成功二片式目鏡，這就是至今仍采用的惠更斯目鏡。 1700～1750 年制成了透射光顯微鏡，利用平面和凹面反光鏡使光線自下往上進行照明。1750～1800 年發(fā)明消色差透鏡，制造了具有粗調(diào)及微調(diào)的

5、調(diào)焦機構(gòu)，并出現(xiàn)了聚光鏡，載物臺上標本可借助螺桿進行移動。1886年蔡司打破一般可見光理論上的極限，他的發(fā)明——阿比式及其它一系列的鏡頭為顯微學(xué)者另辟一新的影像天地。1900～1950 年出現(xiàn)了波長λ=275 納米的紫外光顯微鏡，利用它觀察生物標本對紫外線的吸收性，并提高分辨率。,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,1938年，德國工程師Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一臺透射電子顯

6、微鏡(TEM)。,Max Knoll(1897-1969) Ernst Ruska(1906-1988),,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,1952年，英國工程師Charles Oatley制造出了第一臺掃描電子顯微鏡(SEM)。,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,1982年，諾貝爾化學(xué)獎授予卓越的電鏡應(yīng)用者——英國的分子生物學(xué)家克盧格（A Klug）。1986年，瑞典皇家科學(xué)院將諾貝爾

7、物理學(xué)獎授予電子顯微鏡的發(fā)明者——德國科學(xué)家恩斯特 · 盧斯卡（Ernst Ruska，1906-1988）；授予掃描隧道顯微鏡（STM）的設(shè)計者——德國物理學(xué)家賓尼希（Gerd Binnig，1947-）和瑞士物理學(xué)家羅雷爾（Heinrich Rohrer，1933-）。,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,時至今日，按照各種科學(xué)領(lǐng)域及研究對象的不同要求，利用不同的光學(xué)原理，已設(shè)計制造出多種多樣的顯微鏡。,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史

8、,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,3.生物顯微技術(shù)發(fā)展的方向,技術(shù)上將更快地向定量顯微術(shù)方向發(fā)展；在儀器上不論是光學(xué)顯微鏡還是電子顯微鏡，都將從單一功能的儀器向多功能組合的大型儀器發(fā)展；在操作上將在更大程度上引入電子學(xué)技術(shù)，從而向更高的自動化操作發(fā)展；圖象分析技術(shù)將迅速地在顯微技術(shù)中廣泛的應(yīng)用；設(shè)法解決在超微結(jié)構(gòu)水平上作活體的觀察。,,,,一、顯微技術(shù)發(fā)展簡史,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,1.普通顯微鏡,1） 普

9、通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu),普通光學(xué)顯微鏡由3部分構(gòu)成，即：①照明系統(tǒng)，包括光源（普通鎢絲燈或LED燈）和聚光器（孔徑光闌和聚光鏡）；②光學(xué)放大系統(tǒng)，由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，為了消除球差和色差，目鏡和物鏡都由復(fù)雜的透鏡組構(gòu)成；③機械裝置，用于固定材料和觀察方便。,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,1 目鏡2 鏡筒3 鏡臂4 粗調(diào)焦螺旋5 細調(diào)焦螺旋6 鏡座7 物鏡轉(zhuǎn)換器8 物鏡鏡頭9 載物臺10 聚光器11 標

10、本推進器12 光源,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,被觀察物體AB位于物鏡的前方，被物鏡作第一級放大后成一倒立的實象A’B’。然后此實像再被目鏡作第二級放大，成一虛象A’’B’’,人眼看到的就是虛像A’’B’’, 。,2） 普通光學(xué)顯微鏡的成像原理,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,對任何顯微鏡來說，最重要的性能參數(shù)是分辨率，而不是放大倍數(shù)。分辨率是指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離。這兩個質(zhì)點之間的距離取決于光源波長A，物鏡鏡

11、口角α (標本在光軸的一點對物鏡鏡口的張角)和介質(zhì)折射率N，它們之間的關(guān)系是：,式中：N=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標本對物鏡鏡口的張角）。鏡口角總是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。,鏡口率＝N?sinα/2,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,3） 普通光學(xué)顯微鏡的基本概念,分辨率：能夠把兩個點分辨開的最小距離。人們?nèi)庋鄣姆直媛室话阒挥?.2mm，光學(xué)顯微鏡的分辨率為0.2µm，而電子顯微鏡可達0.2n

12、m，掃描隧道顯微鏡的分辨率更高。放大倍數(shù)：顯微鏡經(jīng)多次成像后最終所成像的大小相對原來物體大小的比值。顯微鏡的總放大倍率為：物鏡放大倍率×目鏡放大倍率。有效放大：對于某一顯微鏡來說，在其分辨能力之內(nèi)的圖像放大。此時的圖像放大不失圖像表面的細節(jié)。無效放大：在顯微鏡分辨能力以外的圖像放大。只是放大了圖像輪廓，不能放大和分辨圖像的表面細節(jié)。可見光照明的顯微鏡分辨率的極限值約為200 nm ，一般人正常眼的分辨率為0.2m

13、m，使用光學(xué)顯微鏡可以使我們分辨清楚細胞的微細結(jié)構(gòu)細節(jié)提高了1000倍，這正是光學(xué)顯微鏡的極限放大倍數(shù)，如果再追求更大倍數(shù)也只能是空放大（無效放大），并不能使細節(jié)更為清晰。,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,景深：又稱焦點深度，指在要求成一副清晰像的前提下，像平面不變，景物沿光軸前后移動的距離。焦長：景物不動，像平面沿光軸前后移動的距離。色差：又稱色像差。可見光不是單色光，它是由波長范圍400至700nm的一系列不同波長的光

14、（即不同顏色的光）組成的復(fù)合光，不同波長的光在通過透鏡時的折射率不同。這樣物方一個點，在像方則可能形成一個模糊色斑。球差：是由于透鏡表面為球面而產(chǎn)生的像差故而稱為球差，或 當透鏡孔徑較大時，由光軸上一物點發(fā)出的光束經(jīng)球面折射后不再交于一點，這種現(xiàn)象叫做球面像差，簡稱球差 。,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,4）不同放大倍數(shù)下的組織,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,,,,二、普通顯微鏡

15、和特殊光學(xué)顯微鏡,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,2.特殊光學(xué)顯微鏡,1）熒光顯微鏡,熒光顯微鏡是利用紫外光或藍紫光照射被觀察樣品，使樣品中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，顯微鏡成像系統(tǒng)借此來顯示樣品中產(chǎn)生熒光成分的分布、結(jié)構(gòu)和數(shù)量。熒光顯微鏡用于研究細胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。熒光顯微鏡技術(shù)是目前在光鏡水平對特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性定位的有

16、力的工具。熒光顯微鏡技術(shù)包括免疫熒光技術(shù)和熒光素直接標記技術(shù)。常用綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)基因與某種蛋白基因融合，在表達這種融合蛋白的細胞中，便可直接觀察到該蛋白的動態(tài)變化。,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,特點：光源為紫外線，波長較短分辨力高于普通顯微鏡；?有兩個特殊的濾光片；光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人目。 ?照明方式通常為落射式。即

17、光源通過物鏡投射于樣品上。,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,2）激光共聚焦掃描顯微鏡,普通熒光顯微鏡下，許多來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率降低，當所觀察的熒光標本稍厚時，傳統(tǒng)熒光顯微鏡一個難以克服的缺點就顯現(xiàn)出來：焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛。激光共焦點掃描顯微鏡以激光作為光源，采共軛聚焦原理和裝置，對樣品進行斷層掃描和成像，進行無損傷觀察和分析細胞的三維空間結(jié)構(gòu)。激

18、光共聚焦掃描顯微鏡的分辨率可以比普通熒光顯微鏡的分辨率提高1.4-1.7倍。所謂共聚焦是指物鏡和聚光鏡同時聚焦到同一個小點，即它們互相共焦點。改變焦點可獲得一系列細胞不同切面上的圖像，經(jīng)疊加后便可重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)。激光共焦點掃描顯微鏡在研究亞細胞結(jié)構(gòu)與組分等方面的應(yīng)用越來越廣泛。,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,利用免疫熒光標記和離子熒光標記探針，該技術(shù)不僅可觀察固定的細胞、組織切片，

19、還可以對活細胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子及生命活動進行實時動態(tài)觀察和檢測，膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)、分子細胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強有力的研究工具。,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,3）暗視野顯微鏡,暗視野顯微鏡的聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進入物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的?？捎^察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。

20、,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,4）相差顯微鏡,光線通過不同密度的物質(zhì)時，其滯留程度也不同。密度大則光的滯留時間長，密度小則滯留時間短。相差顯微鏡可將這種光程差或相位差，轉(zhuǎn)換成振幅差。相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡最主要的不同點是在物鏡后裝有一塊"相差板"，偏轉(zhuǎn)的光線分別通過相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質(zhì)，所以又使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對樣品不同

21、密度造成的相位差起"夸大"作用。最后這兩組光線經(jīng)過透鏡又會聚成一束，發(fā)生互相疊加或抵消的干涉現(xiàn)象,從而表現(xiàn)出肉眼明顯可見的明暗區(qū)別。由于反差是以樣品中的密度差別為基礎(chǔ)形成的，故相差顯微鏡的樣品不需染色，可以觀察活細胞，甚至研究細胞核、線粒體等細胞器的動態(tài)。,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,相差顯微鏡照明原理,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,5）偏光顯微鏡,偏光顯微

22、鏡和普通顯微鏡不同的是：其光源前有偏振片（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（一個偏振方向與起偏器垂直的的起偏器），這種顯微鏡的載物臺是可以旋轉(zhuǎn)的，當載物臺上放入單折射的物質(zhì)時，無論如何旋轉(zhuǎn)載物臺，由于兩個偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時，由于光線通過這類物質(zhì)時發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺便能檢測到這種物體。用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。,,,,二、普通顯微鏡

23、和特殊光學(xué)顯微鏡,,,,二、普通顯微鏡和特殊光學(xué)顯微鏡,6）倒置顯微鏡,倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),切片法,徒手切片法石蠟切片法冰凍切片法組織化學(xué)制片,,涂片法壓片法離析法整體裝片法,非切片法,,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),1.非切片法制片,1）整體封藏法,一般是體積很小或自身為一薄片的低等動物

24、如無脊椎動物的水螅、草履蟲等?；蚣棺祫游锏呐咛ゲ牧希喝珉u胚、蛙胚等。也可取下某一動物體的某部分器官制成封片的，如昆蟲的翅、鳥的羽毛、魚的鱗片等。,鯊魚的盾形鱗片,姜片吸蟲,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),2）涂片法,用于液態(tài)組織，如血液，精液和唾液。,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),3）鋪片法,用于很薄的組織，如腸系膜。,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),4）壓片法,一些柔軟的材料可夾在玻片或蓋片間進行壓碎或壓開，經(jīng)染色后進行觀察。,,,,三、光鏡切

25、片制作技術(shù),1.切片法制片,1）徒手切片法,準備：顯微鏡、鑷子、解剖針、刀片、培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、綢布或紗布、染料。切片：2~3 cm的材料一段，用左手大拇指或食指夾住材料，上方突出于手指2~3 mm，不宜太高，否則材料容易搖動。右手以拇指和食指拿穩(wěn)刀片即可切片。切片時為了避免材料干枯，應(yīng)使材料的切面和刀刃上保持有水，呈濕潤狀態(tài)。每切2~3片后，移入盛有清水的培養(yǎng)皿中。　　如果切面傾斜，應(yīng)立即糾正。過于柔軟的器官，例如幼嫩的葉片

26、，需用胡蘿卜根或馬鈴薯塊莖等作為支持物，將要切的材料夾于其中，然后進行切片。選擇比較完整的切片進行染色和封片。,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),2）石蠟切片法,石蠟切片技術(shù)是顯微技術(shù)上最重要最常用的一種方法，優(yōu)點在于（1）應(yīng)用范圍廣，幾乎適用于所有的植物材料；（2）能切成極薄而且連續(xù)的切片，較清楚地顯現(xiàn)細胞、組織的細微結(jié)構(gòu)；（3）切片可以長期保存，便于以后觀察比較。石蠟切片技術(shù)的整個過程較復(fù)雜，可大體概括為：取材　　　固定　　　脫水　　

27、　透明　　　浸蠟　　　包埋　 　 修塊　　　切片　　　粘片　　　脫蠟復(fù)水 染色　 　　脫水透明 封片,,,,,,,,,,,,,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),,,,三、光鏡切片制作技術(shù),取材：根據(jù)觀察目的不同，選用合適的新鮮材料，要求“精而小”,不在于“大而多”，應(yīng)注意：　?、偃〔牡拇硇?。　?、诓牧闲迈r，大小在0.5—1厘米，有利于固定液的透入?！　、鄣镀J利，立即固定，如不能即

28、刻固定，須盡量防止變干、損傷?！　、茉敿氂涗浫掌?、采集地點、標本名稱、取材部位、固定液種類。固定：用一定的化學(xué)溶液（固定劑）在盡可能保持細胞生活結(jié)構(gòu)的情況下迅速殺死組織的過程。為保存新鮮組織的微觀結(jié)構(gòu)，盡快將組織浸入到酒精，甲醛，苦味酸，Bouin’s 液或Zenker’s液等固定劑中。脫水：用濃度逐漸升高的酒精 (70~100%)將組織中的水完全置換出來。,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),透明：用二甲苯完全置換出酒精。二甲苯是應(yīng)

29、用較廣的一種透明劑，透明力強，但缺點是材料在其中停留過久，容易發(fā)生收縮、變脆、變硬，常用氯仿（三氯甲烷）代替二甲苯。透明主要目的在于使組織中的脫水劑（酒精或丙酮）被透明劑所替代，使石蠟?zāi)茼樌剡M入組織，或增強組織的折光系數(shù)有利于光線的透過，并能與封藏劑混合進行封藏，便于顯微鏡的觀察。浸蠟：在60~62℃時，用液態(tài)石蠟完全置換出二甲苯。室溫時石蠟?zāi)坛晒虘B(tài)，內(nèi)含待切組織。浸蠟應(yīng)在恒溫箱中進行,恒溫箱的溫度要適宜，太高，會使材料收縮，

30、太低，石蠟會凍結(jié)而不能透入組織。,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),包埋：把透足石蠟的材料包埋在石蠟里成為一定的形狀以便切片。,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),修塊與固著：將包埋好的材料切割成小塊，每個小塊包含一個材料。然后按需要的切面將蠟塊切成梯形，切面在梯形的上部（注意上部矩形的對邊平行）。用燒熱的蠟鏟將梯形的底部固定在木塊上。,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),切片: 用切片機將組織切成４~７μm厚的蠟片，然后將其放到溫水上，待其完全展開后，裱到

31、有粘附劑的載玻片上。,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),粘片、展片、烤片：在預(yù)先洗凈并干燥的載玻片上涂上一小滴粘貼劑（用量絕不可多），用洗凈的手指反復(fù)涂勻，然后加1~2滴3％福爾馬林或蒸餾水，用鑷子輕輕將蠟片放在液面上，將此載玻片放在45℃左右的溫臺上，至蠟片受熱慢慢伸直展平為止，用解剖針調(diào)整蠟片在載玻片上的位置，吸去多余水分，置入30℃溫箱中烘干，時間約需24h。染色封片：蘇木精：細胞核染成藍色。伊紅：酸性染料，主要使細胞質(zhì)和細胞外

32、基質(zhì)中的成分著紅色，細胞漿的良好燃料。,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),染色封片：染色方法視材料不同而選擇。下面以植物制片中最常用的番紅與固綠對染的方法為例，說明從脫蠟、染色至最后封藏的全部制片程序（均在染缸中進行）。,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),為了保護細胞蛋白質(zhì)的活性或脂肪成分的存在，在制作切片時，不能選擇石蠟等作為包埋劑，此時可以利用冷凍使組織達到制作切片所需要的硬度。冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然后進行切片的

33、方法。優(yōu)點： 保存酶活性， 抗原保存好，免疫組化應(yīng)用較多。缺點： 形態(tài)不如石蠟切片， 要求有冰凍切片機。,3）冰凍切片法,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),新鮮組織和已固定的組織均可作冰凍切片。防止組織中冰晶形成（速凍或液氮）。應(yīng)視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝組織和淋巴結(jié)時，冷凍箱中的

34、溫度不能調(diào)太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調(diào)在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時，應(yīng)調(diào)至-25℃左右，切含大量的脂肪時，應(yīng)調(diào)至-30℃。,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),①通過生物化學(xué)的方法在原位產(chǎn)生不溶解的有顏色的反應(yīng)產(chǎn)物，來顯示微細結(jié)構(gòu)的位置，然后用顯微鏡觀察，如PAS 反應(yīng)。②待測結(jié)構(gòu)或化學(xué)物質(zhì)被看作抗原(Antigen)，通過非常敏感和專一的免疫反應(yīng)使抗原和被標記的抗體(Antibody)結(jié)合

35、，然后顯示標記物，在原位產(chǎn)生不溶有色的反應(yīng)產(chǎn)物，最后用顯微鏡觀察。,4）組織化學(xué)法,,,,三、光鏡切片制作技術(shù),③放射自顯影(Autoradiography): 給細胞所要代謝的物質(zhì)分子上標記放射性物質(zhì)如 I125等，間隔照相，從而追蹤該物質(zhì)代謝途徑。,免疫組化常用試劑,,,,四、電子顯微鏡,電子顯微鏡是利用電子與物質(zhì)作用后，所產(chǎn)生的電子散射信號來顯示細胞內(nèi)部和表面微細結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)，微細組織，化學(xué)成份和電子分布情況的電子光學(xué)裝置。它以

36、電子波作為光源，電磁場作為透鏡，用熒光屏將肉眼不可見的電子束成像在人們眼前。 在真空系統(tǒng)中，高速電子照射樣品時，一部分入射電子與樣品物質(zhì)中的原子核外電子發(fā)生碰撞，引起入射電子方向和能量發(fā)生改變，形成所謂散射現(xiàn)象，樣品中不同結(jié)構(gòu)和區(qū)域電子的致密程度不同，引起的散射程度也不同，所以穿過樣品的出射電子束是不均勻的，束內(nèi)電子密度各處互有差異，當其投射到熒光屏上形成可見光圖像時，該圖像就會顯示出樣品的結(jié)構(gòu)信息。,1. 電子顯微鏡概述,,,,四

37、、電子顯微鏡,調(diào)控通過電磁場線圈的電流就可以調(diào)控磁場強度，從而改變電子偏轉(zhuǎn)角度大小，即改變電子束聚焦的焦點，因此電鏡改變放大倍數(shù)是通過調(diào)節(jié)通過磁透鏡電流大小來實現(xiàn)的，不需要像光鏡那樣要更換不同倍數(shù)的鏡頭。根據(jù)電鏡的電子束照射樣品的方式不同、利用電子散射信號方式不同和對電子束加壓的不同，可以將電子顯微鏡分為多種類型，細胞生物學(xué)常用的有透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope, TEM)和掃描電子

38、顯微鏡（Scanning electron microscope, TEM）。,,,,四、電子顯微鏡,2.透射電子顯微鏡,原理：與光學(xué)顯微鏡相似，不同的是透射電子顯微鏡用電子束作為光源，用電磁場作透鏡。電子束投射到樣品時，可隨組織構(gòu)成成分的密度不同而發(fā)生相應(yīng)的電子散射，如電子束投射到質(zhì)量大的結(jié)構(gòu)時，電子被散射的多，因此投射到熒光屏上的電子少而呈暗像，電子照片上則呈黑色，稱電子密度高。反之，則稱為電子密度低。,,,,四、電子顯微鏡,中

39、性粒細胞 （透射電鏡）,,,,四、電子顯微鏡,,,,四、電子顯微鏡,電子槍：是發(fā)射電子的照明光源。聚光鏡：是把電子槍發(fā)射出來的電子會聚而成的交叉點進一步會聚后照射到樣品上。物鏡：成一次像，決定透射電鏡的分辨本領(lǐng)，要求它有盡可能高的分辨本領(lǐng)、足夠高的放大倍數(shù)和盡可能小的像差。通常采用強激磁，短焦距的物鏡。放大倍數(shù)較高，一般為100～300倍。中間鏡：成二次像，弱激磁的長焦距變倍透鏡，0～20倍可調(diào)。投影鏡：短焦距強磁透鏡，

40、最后一級放大像，最終顯示到熒光屏上，稱為三級放大成像。,,,,四、電子顯微鏡,真空系統(tǒng)：由機械泵、油擴散泵或離子泵、聯(lián)動控制閥門、真空排氣管道、空氣過濾器和用于真空度指示的真空測量規(guī)等組成。供電系統(tǒng)：透射電鏡需要兩部分電源：一是供給電子槍的高壓部分，二是供給電磁透鏡的低壓穩(wěn)流部分。機械系統(tǒng)：包括電鏡座、標本室、磁屏蔽外殼、鏡筒、制冷系統(tǒng)和控制臺等。,,,,四、電子顯微鏡,使用注意事項：（1）透射電鏡及其附屬設(shè)備中有高壓電、低溫

41、、高壓氣流、電離輻射等危險因素，因此不正確的使用有可能造成儀器損壞，甚至造成人身傷害。（2）請勿用透射電鏡觀察磁性樣品，磁性樣品有可能給電鏡造成嚴重傷害。（3）嚴禁用手直接觸摸樣品桿把手以外的部分，尤其是樣品桿頂端的任何部位。 （4）電鏡樣品臺紅燈亮?xí)r不要插入或拔出樣品桿，樣品臺回零之前不要插入或拔出樣品桿。（5）任何機械操作都不要太用力（包括裝卸樣品，插拔樣品桿，操作旋 鈕、按鈕等）。,,,,四、電子顯微鏡,應(yīng)用：主要用于

42、觀察組織和細胞內(nèi)的亞顯微結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)、核酸等大分子的形態(tài)結(jié)構(gòu)及病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。是區(qū)別細胞凋亡與細胞壞死的最可靠的辦法。,,,,四、電子顯微鏡,線粒體,新型冠狀病毒,,,,四、電子顯微鏡,3.掃描電子顯微鏡,,,,四、電子顯微鏡,掃描電鏡成像并非來自光源電子束本身，類似激光掃描共聚焦熒光顯微鏡，成像來自熒光，而非光源的激發(fā)光。高能電子束與樣品成分的原子核和電子發(fā)生碰撞，使樣品表面產(chǎn)生二次電子發(fā)射、背反射電子、吸收電子、X射線、俄

43、歇電子、陰極發(fā)光等物理信號，二次電子發(fā)射量是被選用作成像的信號，二次電子發(fā)射量隨樣品表面形貌而變化，包含著此時刻光源電子束照射樣品表面此點形貌信息。,,,,四、電子顯微鏡,在掃描電鏡中，二次電子檢測器一般是裝在入射電子束軸線垂直的方向上。,,,,四、電子顯微鏡,,,,四、電子顯微鏡,,,,四、電子顯微鏡,電子光學(xué)系統(tǒng)：電子槍、電磁透鏡信號檢測系統(tǒng)：二次電子探測器、光電倍增管圖像顯示和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：CRT掃描系統(tǒng)：偏轉(zhuǎn)線圈、掃

44、描波發(fā)生器真空系統(tǒng)：機械泵、油擴散泵、閥門等電源：高壓電源、真空系統(tǒng)電源等放大倍數(shù)：掃描電鏡二次電子像的放大倍率由屏上圖像的大小與電子束在樣品上掃描區(qū)域的大小的比例決定：M=像的大小/掃描區(qū)域的大小。,SEM的基本結(jié)構(gòu),,,,四、電子顯微鏡,應(yīng)用：主要用來觀查組織、細胞表面或斷裂面的超微結(jié)構(gòu)及較大的顆粒性樣品的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)。,紅血球,可以用計算機將黑白照片處理成彩色,,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),1.透射電子顯微鏡樣品

45、制備,透射電子顯微鏡樣品制備主要是超薄切片和染色技術(shù)。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50～100nm）。超薄切片與常規(guī)石蠟切片制作原理相似，即先使用固定劑將組織和細胞固定，使其盡量保持原來生活狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，然后經(jīng)過脫水、浸透、聚合、包埋和切片制成超薄切片，但兩種切片所用固定劑和包埋劑等有所不同。,,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),通常以戊二醛和鋨酸固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進

46、的方式推進樣品切片，切片厚度50～100nm。,萊卡超薄切片機,,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),染色技術(shù)：一般采用重金屬鹽染色，以增大反差。利用細胞微細結(jié)構(gòu)和成分對重金屬鹽的結(jié)合和吸附特性不同，對透射電鏡樣品進行染色處理，即所謂的電子染色。,TEM顯示胰腺腺泡細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),負染技術(shù)：負染就是用

47、重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果。,肌動蛋白纖維的負染電鏡照片,,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),2.掃描電子顯微鏡樣品制備,制備掃描電鏡樣品的總要求：在不損傷樣品原始結(jié)構(gòu)狀態(tài)的情況下，保證樣品的體積和表面積不發(fā)生改變，充分暴露樣品表面的微細結(jié)構(gòu) 。生物樣品的特性： 含水量高

48、 質(zhì)地柔軟 導(dǎo)電性差 二次電子產(chǎn)率低 對熱、電子束等敏感,,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),掃描電鏡生物樣品要求： 不含水份 具有較高的二次電子發(fā)射率 良好的導(dǎo)電性 耐熱性 最大限度的保持樣品的形貌,,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),掃描電鏡

49、樣品常規(guī)制備的操作程序：,,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),冰凍蝕刻：亦稱冰凍斷裂，標本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，進行冰凍。然后用冷刀驟然將標本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)，稱為蝕刻。蝕刻后，向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強反差和強度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜。復(fù)膜顯示出了標本蝕刻面的形態(tài)，在電鏡下得到的影像即代表標本中細胞斷裂面

50、處的結(jié)構(gòu)。,,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),酵母細胞冰凍蝕刻電鏡照片,,,,五、電子顯微鏡樣品制作技術(shù),樣品制備技術(shù)的協(xié)同發(fā)展： 表現(xiàn)樣品的二維超微結(jié)構(gòu)、應(yīng)用廣泛的超薄切片術(shù)； 顯示表面超微結(jié)構(gòu)、立體感較強的掃描電鏡樣品制備技術(shù)； 呈現(xiàn)生物膜的斷裂面超微結(jié)構(gòu)的冷凍蝕刻技術(shù)； 用于細胞內(nèi)化學(xué)成分的定性和定位研究的電鏡細胞化學(xué)技術(shù)；

51、 進行細胞內(nèi)抗原（抗體）的定性和定位研究的免疫電鏡技術(shù)； 探測細胞內(nèi)大分子合成、運輸動態(tài)過程的電鏡放射自顯影技術(shù)； 研究病毒和生物大分子等懸浮材料的負染術(shù).,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,胰島,小腸絨毛,1. 形態(tài)觀察（正常與病理狀態(tài)）,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,DC的超微結(jié)構(gòu),心肌閏盤,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,SEM顯示腸絨毛,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,SEM顯示巨

52、噬細胞表面,精子進入卵子的瞬間,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,SEM顯示血凝塊,SEM顯示鐮刀形紅細胞,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,2. 電鏡細胞化學(xué)技術(shù),電鏡細胞化學(xué)是從光鏡組織化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種超微結(jié)構(gòu)技術(shù)，是利用特定的化學(xué)顯色反應(yīng)，形成高電子密度、不溶性的反應(yīng)產(chǎn)物沉淀在細胞原位，借助電子顯微鏡進行超微結(jié)構(gòu)的原位分析。主要用于研究細胞內(nèi)各種成份在細胞超微結(jié)構(gòu)水平的分布情況，以及這些成份在細胞活動過程中的動態(tài)變化，以闡明

53、細胞的化學(xué)和生化功能以及各種細胞成份在生理、病理情況下與細胞結(jié)構(gòu)和功能等之間的關(guān)系。,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，利用抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，在分子水平上檢測某些具有抗原性的物質(zhì)，并觀察它在細胞內(nèi)的定位的一種方法。目前免疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù)，免疫鐵蛋白技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)，此外還有抗體雜交技術(shù)、凝集素電鏡標記技術(shù)和鐵蛋白-抗鐵蛋白電鏡復(fù)合物技術(shù)。,2.1 免疫電鏡技術(shù)

54、,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,（1） 酶免疫電鏡技術(shù),酶免疫電鏡技術(shù)是將酶作為抗原或抗體的標記物，利用酶的高效率的催化作用對其底物的反應(yīng)形成不同的電子密度產(chǎn)物，借助于電子顯微鏡觀察，證明酶的存在，從而對抗原進行定位。,結(jié)果判定：在已知陽性、陰性樣品成立的前提下，出現(xiàn)高電子密度的顆粒，即指示抗原抗體的存在。,先通過冰凍切片或震動切片獲得厚切片，漂洗后的厚切片可按免疫組化步驟進行標記染色，顯色后再進行鋨酸后固定以及電鏡包埋切片處理。,,,

55、,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,（2） 膠體金免疫電鏡技術(shù),利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負電荷的性質(zhì)，使其與抗體相互吸引從而將抗體標記。再以金標記的抗體與待檢抗原相互結(jié)合，由于金顆粒的電子密度高，電鏡觀察到金顆粒的位置，即抗原所在。,優(yōu)點：①膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不發(fā)生明顯的變化；②金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒清晰可辨，易精確定位；③不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對細胞表面的抗原

56、、受體進行標記定位觀察；④膠體金標記物易于制備，而且可以根據(jù)需要制備不同大小的膠體金，因此可以進行免疫電鏡的雙重標記；⑤根據(jù)抗原抗體反應(yīng)部分結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少，可進行粗略的免疫細胞化學(xué)定量研究。,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,血小板表面膠體金標記GPIb單抗 ×9000,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,（3）免疫鐵蛋白技術(shù),鐵蛋白分子量78萬，含鐵量高具有顆粒大，電子密度高，散射力強，分辨率高等特點，可用于細胞膜表面抗原

57、的定位。鐵蛋白免疫電鏡技術(shù)是以鐵蛋白標記抗體，再以鐵蛋白抗體與待檢抗原作用。通過電鏡檢查，觀察到鐵蛋白抗體所在的位置，即抗原所在。結(jié)果判定：在已知對照樣品成立的前提下，凡是出現(xiàn)黑色的鐵分子顆粒即表示抗原的存在，判定陽性(+)，否則判為陰性(－)。,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,2.2 電鏡酶細胞化學(xué)技術(shù),原理：（1）水解酶,（2）氧化還原酶,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,常見酶的電鏡細胞化學(xué)：,（1）酸性磷酸酶：是一種水解

58、酶，常存在于溶酶體和高爾基體上，常被看作是溶酶體的標記酶。,酸性磷酸酶在溶酶體和高爾基體中陽性反應(yīng) ×15000,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,（2）堿性磷酸酶：水解酶，主要位于細胞膜，在小腸上皮微絨毛和腎小管上皮刷狀緣部位特別明顯，是細胞膜的標志酶之一。,堿性磷酸酶在腎小球足細胞表面和紅細胞表面中表達 ×24000,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,（3）葡萄糖－6－磷酸酶：水解酶，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要標志酶。

59、（4）焦磷酸硫胺素酶：水解酶，是高爾基體很重要的標志酶之一。（5）琥珀酸脫氫酶和細胞色素氧化酶：存在于線粒體中，定位于線粒體內(nèi)膜和嵴 。,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,琥珀酸脫氫酶在心肌細胞線粒體中陽性反應(yīng) ×30000,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,細胞色素氧化酶在心肌細胞線粒體中陽性反應(yīng) ×6000,,,,六、生物顯微技術(shù)的應(yīng)用,（6）髓過氧化物酶：主要分布于白細胞，定位于粒細胞和單核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)