生物電子顯微技術(shù)

1、生物電子顯微技術(shù)---透射電鏡結(jié)構(gòu)與原理,濱州醫(yī)學(xué)院電鏡室劉文波辦公室：實驗B樓B103室聯(lián)系電話：0535-6913074,電子顯微學(xué)的發(fā)展史,人眼：人眼的分辨能力約為0.1~0.2mm。光學(xué)顯微鏡：光學(xué)顯微鏡分辨率約為0.2um。 電子顯微鏡：電鏡產(chǎn)生的理論基礎(chǔ)1.1897年，Thomson發(fā)現(xiàn)了電子，并證明它是一種帶負電荷的粒子。2.1924年，法國數(shù)理學(xué)家de Broglie提出了微觀粒子的波粒二重性原理，并

2、 推導(dǎo)出電子的波長與加速電壓之間的關(guān)系為： λe≈ (nm) 可見：加速電壓越高，對應(yīng)電子束的波長越短。 計算表明電子波長比可見光波長短的多,如加速電壓為80KV時，電子的波長約為0.00418 nm ，相當(dāng)于可見光中綠光波長的十萬分之一。3.1926年，德國應(yīng)用物理學(xué)家H.Busch提出了幾何電子光學(xué)理論。他指出：加速電子在軸對稱電場或磁場中的運動

3、規(guī)律完全服從幾何光學(xué)定律，進而制造出了靜電透鏡和電磁透鏡。,,電子顯微學(xué)的發(fā)展史,電子顯微鏡的發(fā)明 1931~1933年，德國M.Knoll和E.Ruska發(fā)明了第一臺電子顯微鏡。（結(jié)構(gòu)簡單，只有兩級放大透鏡和16×） 1938年，德國，E.Ruska，第1臺真正的透射電鏡，放大倍數(shù)：1200倍 （與當(dāng)時最好的光學(xué)顯微鏡的放大倍數(shù)相當(dāng)）  1939 年

4、，德國 Siemens 公司生產(chǎn)了第一臺商品透射電鏡，其分辨率為 10nm 左右 。 目前，最新透射電鏡分辨率達到0.07nm，放大倍數(shù)達到150萬倍。 （Ruska：被稱為電鏡之父，并獲得1986年諾貝爾物理學(xué)獎，電鏡的發(fā)明被認為是20世紀最重要的科學(xué)發(fā)明之一）,,December 10, 1986Nobel Prize in Physics (City-Hall of Stockholm),,htt

5、p://ernst.ruska.de/daten_e/mainframe_e.html,1986年諾貝爾物理學(xué)獎獲得者,Ernst Ruska Gerd Binnig Heinrich Rohrer 發(fā)明電子顯微鏡（1931年） 發(fā)明掃描隧道顯微鏡（1982年）,第一臺透射電子顯微鏡光路圖及其與光學(xué)顯微

6、鏡的比較,這是Ruska在1931-1933年完成的。從這時起，電子顯微鏡的基本光學(xué)原理始終沒有改變過。后來的改進主要是提高分辨本領(lǐng)和使用性能等。,電子顯微鏡的分類,一、電子散射(electron scattering)現(xiàn)象電子散射是高能入射電子與固體樣品相互作用所產(chǎn)生的一種物理現(xiàn)象。1.直接透射電子：特點：電子運動方向不變，速度（能量）不變。2.彈性散射電子：特點：電子運動方向改變，但速度（或能量）保持不變。3.非彈性散射

7、電子(inelastic electron)：特點：電子運動方向改變，速度（或能量）也發(fā)生改變。,電子顯微鏡的分類,二、電子與樣品的作用方式1.泛光式：電子束以一定的尺寸照射在樣品上，使用中電子束固定，樣品的一定范圍被同時照射并同時被觀察記錄。2.掃描式：電子束以極細的點在樣品表面按照一定的方向和速度移動，如同電視成像一樣。樣品上待觀察區(qū)域被電子束逐點逐行照射，其結(jié)構(gòu)也被逐點逐行的成像。,,入射電子與樣品的兩種作用方式,電子顯微鏡

8、的分類,三、電子顯微鏡的分類依據(jù)：按所采用的信號及電子束與樣品的作用方式。1.透射電子顯微鏡(TEM)：利用泛光式電子束及透射電子（包括直接透射電子，彈性散射電子和非彈性散射電子）成像。2.掃描電子顯微鏡(SEM)：利用掃描式電子束及二次電子（包括背散射電子）成像。用于觀察樣品表面的形貌結(jié)構(gòu)。3.掃描透射電子顯微鏡(STEM)：既透射電鏡的功能又具有掃描電鏡的功能，通常是在透射電鏡的基礎(chǔ)上加裝掃描附件。4.電子探針(EMP)：

9、利用掃描式電子束及特征X-射線成像。用于樣品表層微區(qū)化學(xué)成分定性或定量分析。5.分析電子顯微鏡(AEM)：透射電鏡或掃描電鏡配能譜儀或波譜儀。6.俄歇電子譜儀(Auger ES)：利用掃描式電子束及俄歇電子成像。其中，透射電鏡和掃描電鏡在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛。,電子顯微鏡的分類,四、透射電鏡的分類按最高加速電壓分類：1.普通透射電鏡：加速電壓≤120KV，主要應(yīng)用于生物學(xué)等領(lǐng)域。2.高壓透射電鏡：200KV≤加速電壓≤5

10、00KV，數(shù)量多，在材料領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛。3.超高壓透射電鏡：加速電壓≥1000KV，體積龐大、價格昂貴、數(shù)量少。,FEI Morgagni ( 100KV) FEI Tecnai? Twin 12 (120KV),JEOL JEM-1011 (100KV) JEOL JEM-1400 (120KV),HITACHI H-7650(120KV),FE

11、I Tecnai F20 (200KV) HITACHI H-9500(300KV),HITACHI H-1500(1300KV),JEOL 3000KV超高壓電鏡,FEI Qunta200 掃描電子顯微鏡,JEM-1200 EX 透射電鏡（帶掃描附件）,JAX-8100電子探針儀,JEM-1400型透射電子顯微鏡,透射電子顯微鏡工作原理,透射電子顯微鏡是以波長極短的電子束做照明源，以電磁透鏡聚焦成

12、像的一種高分辨本領(lǐng)、高放大倍數(shù)的電子光學(xué)儀器。對燈絲加上一定的工作電壓使其發(fā)射電子束，經(jīng)柵極的會聚作用和陽極的加速作用，以一定直徑的束斑照射下來，經(jīng)過聚光鏡的進一步會聚作用照射在下面的樣品上。透過樣品的電子束將帶有樣品結(jié)構(gòu)，經(jīng)過物鏡、中間鏡和投影鏡的多級放大作用，最后照射在熒光屏上，激發(fā)熒光素發(fā)光，從而在熒光屏上呈現(xiàn)出放大的樣品圖像。在熒光屏下方是照相室，可以將樣品的放大圖像曝光在底片上，經(jīng)過顯影、定影后將圖像保存下來。,電子光學(xué)系統(tǒng)

13、,電子光學(xué)系統(tǒng)即電鏡的鏡體。由于機械剛度的要求，鏡體一般是直立的，即：上端是照明系統(tǒng)，中部是成像系統(tǒng)，下端是像的觀察和記錄系統(tǒng)，由觀察室和照像室組成。 優(yōu)點：①直立的垂直鏡筒要求最小的支撐。②由于透鏡本身重量向下壓在透鏡之間的真空密封圈上，有助于保持真空不漏氣。電鏡的鏡筒自上而下可以分成三個主要部分：1.照明系統(tǒng)：由電子槍加上一個或幾個聚光鏡組成。2.成像系統(tǒng)和換樣品機構(gòu)：包括：樣品室（可以加入樣品并按要求使樣品在X、Y軸平移

14、，高檔樣品臺還能控制樣品在垂直Z軸方向的移動以及在TX、TY兩個方向的旋轉(zhuǎn)。 成像系統(tǒng)：由物鏡、中間鏡和投影鏡等組成。3.圖像觀察和記錄系統(tǒng)：包括熒光屏、底片照相室、CCD等圖像觀察和記錄裝置。,,,,照明系統(tǒng),一、電子槍 電子槍是電鏡的照明源，能產(chǎn)生亮度極高的細電子束。電子槍由燈絲陰極、柵極（或稱韋氏圓筒）和加速陽極組成。燈絲是用直徑0.1mm的鎢絲做成V字形，通電加熱至2500-2800K時，在尖端即產(chǎn)生

15、熱電子發(fā)射，形成照明束。在燈絲下方為陽極，起加速電子的作用。柵極用于控制電子束形狀和發(fā)射強度?，F(xiàn)代電鏡一般采用自給柵偏壓電子槍，其優(yōu)點是柵偏壓電阻起負反饋作用，從而能穩(wěn)定電子束流的作用。由于柵極的排斥作用，使電子會聚成束。其中束交叉點處束徑約50um，電子密度最高，是電鏡的實際電子源。,,自給柵偏壓電子槍工作示意圖,照明系統(tǒng),若燈絲處于飽和狀態(tài)時，逐漸減少加熱電流使之比飽和點稍小一點，此時屏上出現(xiàn)如下圖的圖像。此稱燈絲像，中心亮斑是

16、燈絲尖的像，周圍的"暈輪"是柵極帽的像，此燈絲像在電鏡調(diào)整中很有用,如燈絲像是對稱的話則燈絲是對中的，否則燈絲是不對中的。,照明系統(tǒng),二、聚光鏡聚光鏡的作用是把來自電子槍的電子束進一步匯聚，并照射到樣品上。雙聚光鏡系統(tǒng)：C1是一個強透鏡，它的作用是把有效光源的尺寸縮小，最小可達1-2um。第二聚光鏡(C2)是一個弱透鏡，是為了使照明孔徑角足夠小和在聚光鏡與物鏡之間提供一個較大的樣品空間，以便能夠放進樣品臺以及其它

17、的附件。第二聚光鏡用以控制照明亮度、照明孔徑角和照明斑的尺寸，在第二聚光鏡之下裝有第二聚光鏡活動光闌(100，200，300，400um的圓孔)，根據(jù)需要可選取不同的光闌孔。,從樣品平面看，當(dāng)C1焦距確定后，C2處于正聚集狀態(tài)時，照射樣品面積最小、最亮；散焦時，亮度降低，照射面積增大。所以，調(diào)節(jié)C2工作電流改變聚集狀態(tài)，可以方便地連續(xù)控制樣品上的被照射面積和亮度，進而改變熒光屏上光斑大小和亮度。 在電鏡的實際操作中，就是通過改變C

18、2的電流來改變光斑大小和亮度的。,成像系統(tǒng),成像系統(tǒng)包括樣品室、物鏡、中間鏡和投影鏡等樣品室 樣品室位于第二聚光鏡下面。樣品載于銅網(wǎng)上，銅網(wǎng)放在樣品架(或稱樣品桿)上，插入樣品室。,利用樣品移動旋桿來移動樣品的水平位置（X-Y方向）,日立H-600型 透射電鏡,電機控制樣品移動示意圖,成像系統(tǒng),物鏡 物鏡位于在樣品室下面。其作用是形成樣品的第一級放大像和通過調(diào)節(jié)物鏡線圈的激勵電流，相應(yīng)地改

19、變物鏡的焦距從而對像進行聚焦。 物鏡是電鏡的最關(guān)鍵部分，由它對樣品做第一級放大，物鏡中任何缺陷都將被成象系統(tǒng)其它透鏡進一步放大。因此，電鏡的分辨本領(lǐng)主要取決于物鏡的分辨本領(lǐng)， 物鏡中裝有一活動光欄，是由非磁性金屬如鉑或鉬制成，一般有3~ 4個大小不同的孔供選擇。物鏡光欄能提高成像的反差。輕微改變物鏡電流能起到聚焦圖像的作用。中間鏡 中間鏡的作用是把物鏡形成的一次放大像或衍射花樣經(jīng)多級放大后投射到投射鏡的

20、物平面上。投影鏡 投影鏡的作用是把中間鏡形成的放大像再經(jīng)過放大并投射到熒光屏上，從而形成終象。 電鏡的總放大率為所有成像透鏡放大率之積， 即：Mall = Mo × Mi1 × Mi2 × MP 電鏡總放大倍率變化的實現(xiàn)方法：1.控制某級或幾級透鏡的是否工作來實現(xiàn)。2.利用中間鏡倍率的變化來實現(xiàn)。,圖像觀察與記錄系

21、統(tǒng),觀察室 在投射鏡下面是像的觀察和記錄系統(tǒng)，終像將顯示在熒光屏上。大熒光屏（直徑160mm）于觀察，小熒光屏（直徑20mm）用于拍照聚焦。,照相室 在大熒光屏的下面是照相暗盒，用于把終像拍攝記錄在底片上。而且由于照相底片的分辨本領(lǐng)大大高于熒光屏，因此，拍攝出來的底片往往含有在熒光屏上直接觀察時看不到的細節(jié)。 多數(shù)新購電鏡都加配了CCD數(shù)字成像系統(tǒng)。,冷卻水系統(tǒng),作用：為電鏡的正常工作提供相對恒定的溫度環(huán)

22、境，提高儀器工作的穩(wěn)定性。組成：冷卻水機、冷卻水通道、水壓檢測保護裝置等。由于要給抽真空的油擴散泵冷卻，所以必須保證在關(guān)閉電鏡后，冷卻水至少再繼續(xù)工作十分鐘才能關(guān)閉，否則由于擴散泵油得不到充分冷卻而污染鏡筒，降低儀器分辨率。,循環(huán)冷卻水系統(tǒng)示意圖,真空系統(tǒng),電鏡真空系統(tǒng)的組成：1.真空泵（包括機械泵和油擴散泵，為抽真空設(shè)備）2.真空管道及自動閥門系統(tǒng)（真空管道包括連接管道和鏡筒內(nèi)空間，真空閥門既有電磁閥門，又有氣壓閥門，這需要空

23、氣壓縮機為其提供一定壓力的空氣。）3.真空檢測裝置（包括皮喇尼真空規(guī)和潘寧規(guī)，用于檢測真空系統(tǒng)各部分的真空度）常用壓強單位： 標準大氣壓、毫米汞柱(mmHg)、托（乇）(Torr)、帕斯卡(Pa) 1標準大氣壓=760毫米汞柱=1.013×105帕斯卡 1托=1毫米汞柱≈133帕電

24、鏡鏡筒真空的獲得： 電鏡鏡簡要求真空度一般約為10-3Pa。常采用兩級泵串聯(lián)：第一級是機械泵獲得10 Pa~1 Pa的低真空，作為第二級泵的預(yù)真空；第二級采用油擴散泵使真空到達10-3Pa。對于要求真空度高于10-3Pa的電鏡，往往需要三級串聯(lián)系統(tǒng)，第三級通常采用吸附泵或擴散泵。若采用渦輪分子泵、離子泵等則可以獲得更高的真空。,真空機械泵與空氣壓縮機,,油擴散泵外形,JEM-1400透射電鏡 真空系統(tǒng)工作界面,

25、抽高真空的必要性：高速運動的電子與氣體分子相互碰撞，使電子發(fā)生散射，引起“眩光”碰撞使氣體電離引起電子束的不穩(wěn)定或“閃爍”縮短燈絲壽命污染樣品真空系統(tǒng)的組成：真空泵（前級機械泵、油擴散泵或離子泵）真空管道與控制閥門真空檢測系統(tǒng)（皮喇尼真空規(guī)和潘寧真空規(guī)）,JEM-1400透射電鏡鏡筒結(jié)構(gòu),透射電鏡的一般操作順序,開機①接通電源，打開冷卻水；②抽真空：預(yù)抽真空（一般不超過5min）→加熱油擴散泵（一般需20～25min

26、）→抽高真空→約5min后儀器可進入工作狀態(tài)；③設(shè)定高壓值并接通高壓；④接通各透鏡工作電源； ⑤加燈絲束流至所需值；此時，熒光屏上應(yīng)出現(xiàn)光斑。,透射電鏡的一般操作順序,加入要觀察的樣品根據(jù)需要改變放大倍數(shù)，利用第二聚光鏡改變光斑大小和亮度，利用物鏡聚焦圖像，在熒光屏上進行圖像觀察，必要時可拍照保存。觀察結(jié)束后，應(yīng)依次關(guān)閉燈絲、透鏡電源和高壓，取出樣品，關(guān)閉電鏡主機電源。并做好使用記錄。約10分鐘后關(guān)閉冷卻水系統(tǒng)。,,,