電子顯微鏡原理2015年新

1、1,上海水產大學生命學院周平凡,光鏡與電鏡技術,2,第二部分:電子顯微鏡技術（電子顯微鏡和電子顯微術的總稱）,3,一、概 述：第一章:電子顯微鏡的原理和結構第一節(jié):幾個常用的基本概念第二節(jié):透射電子顯微鏡第三節(jié):掃描電子顯微鏡第四節(jié):其他類型的電子顯微鏡,第二部分:電鏡技術,4,第二章:超薄切片技術第一節(jié):取材第二節(jié):固定和固定劑第三節(jié):脫水第四節(jié):浸透和包埋第五節(jié):超薄切片,第二部分:電鏡技術,5,第三章:

2、電子染色技術第一節(jié):電子顯微鏡標本的正染色第二節(jié):電子顯微鏡標本的負染色第三節(jié):半薄切片染色,第二部分:電鏡技術,6,第四章:掃描電鏡生物樣品制備技術第一節(jié):取材和標本的預處理第二節(jié):生物樣品的干燥第三節(jié):生物樣品的導電法,第二部分:電鏡技術,7,一、概 述,8,9,透射電鏡TEM（transmission electron microscope） 觀

3、察細胞內部結構 掃描電鏡SEM（scanning electron microscope) 觀察組織或細胞表面的立體結構,透射電子顯微鏡,掃描電子顯微鏡,電子顯微鏡的分類：,10,,,,,,電子顯微鏡照片,透射電子顯微鏡拍攝的照片,掃描電子顯微鏡拍攝的照片,,細胞核,,紅血球,11,一、概 述,12,一、概 述,13,電鏡具有很高的分辨本領,能觀察

4、極微小的結構。但是電鏡不能直接觀察天然狀態(tài)下的生物標本,必須通過各種技術將生物標本制成特殊的電鏡生物樣品,才能放入電鏡進行觀察,這些電鏡樣品制備技術稱為電子顯微術。 電鏡能在生物醫(yī)學領域中廣泛使用,在很大程度上是由于電子顯微術的改進和發(fā)展。電子顯微術種類很多,這里僅介紹幾種常用的技術。,一、概 述,14,通過多種電子顯微術的配合----能了解生物樣品的化學組成、形態(tài)結構和生理功能的關系。 電鏡技術----無論在生物技

5、術的基礎研究中、還是在臨床醫(yī)學, 都有著廣闊的發(fā)展前景。,一、概 述,15,一、電子顯微鏡的概況 透射電鏡的點分辨率達到了2-3A,晶格分辯率已達到1A左右,已使人們能用電鏡直接觀察原子象； 除透射電鏡外,發(fā)展了多種電鏡,如掃描電鏡、掃描透射電鏡、分析電鏡等,使我們能對樣品進行綜合研究。,一、概 述,16,（一）透射電鏡 透射電鏡----是利用電子射線穿透樣品后放大而成像的一種電鏡。 主要優(yōu)點----分

6、辨率高,可用來觀察組織和細胞內部的超微結構以及微生物和生物大分子的全貌,在生物醫(yī)學上的應用最為廣泛。 加速電壓----一般透射電鏡（加速電壓小于120KV）,高壓透射電鏡（加速電壓在120KV與500KV之間）,超高壓透射電鏡（加速電壓大于500KV）。,一、概 述,17,一、概 述,18,二、電鏡成象的原理,19,一、概 述,20,1、一般透射電鏡：就是最常用的100KV電鏡。 這種電鏡的分辨率高(點3A,晶格1

7、.4A),但穿透本領小,觀察樣品必須很薄,如小于0.1微米的超薄切片、負染樣品和復型膜等。 這種電鏡在生物醫(yī)學上的應用已相當普及。,一、概 述,21,3、超高壓透射電鏡：已有500KV、1000KV和3000KV的超高壓電鏡。 這種電鏡具有穿透能力強、輻射損傷小、可以配備環(huán)境樣品室及進行各種動態(tài)觀察等優(yōu)點,分辨率也已達到或超過100KV電鏡的水平。 在超高壓電鏡上附加充氣樣品室,使人們有可能觀察活細胞內超微結構

8、的動態(tài)變化,對生物醫(yī)學工作者很有吸引力。這種電鏡龐大而且昂貴,遠非一般實驗室所能裝備。,一、概 述,22,東京大學工學院125萬伏超高壓電鏡（JEOL–ARM–1250），該電鏡價值1000萬美元，有三層樓那么高，是世界上精確度最高的電鏡之一，主要用于原子結構和物質的特性研究。,23,,24,,25,該電鏡的開放管理時，該電鏡的技術工作委員會主任市野漱告訴我們，他的電鏡每天24小時向“全世界”開放。 盡管是高精度特大型電鏡，他

9、們仍然實行用戶經培訓合格后自行上機的開放模式。 原則上，電鏡實行測試收費管理，但他們電鏡開放的重點是從事高水平的測試服務與科學研究。,26,用戶的樣品不需要在這樣高水平的電鏡上測試，即便是付費，他們也不予測試，因為這等于是浪費了高水平的資源。相反，如果用戶提出的樣品或課題有很高的學術、科學技術價值，即便資費不夠，他們也會主動接受。每年提供3％的運行費用。,27,可以根據用戶項目水平的高低，他們可以采用合作方式開展測試研究，甚至免

10、費提供測試和研究。正由于他們有這樣的開放與合作原則，多年來，他們的電鏡在高水平研究方面發(fā)揮了重要作用，取得了許多世界一流的學術成果。,28,用戶提出的樣品和研究有很高的價值，他們甚至可以提供幾個月的免費食宿和測試，開展合作研究。正因為如此，他們也做出了很多高水平的成果，在全世界的同行中享有很高的知名度。,29,國外實驗室倡導電子顯微鏡室對外開放：1、高年級學生2、研究生3、博士生4、科研人員,30,,,31,,,32,U

11、CLA納米系統(tǒng)實驗室,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,,50,（二）掃描電鏡 掃描電鏡是利用電子射線轟擊樣品表面,引起二次電子等信號的發(fā)射,經檢測裝置接收后成像的一種電鏡。特點是景深長,所獲得的圖象立體感強,可用來觀察生物樣品的各種形貌特征。 在生物醫(yī)學中,采用不同的樣品制備技術可觀察不同的結構,如用臨界點干燥方法可觀察樣品的表面形貌； 用冷凍

12、割裂方法可觀察樣品割裂面的結構,用鑄型方法可觀察管腔內表面的結構等。,一、概 述,51,一、概 述,52,1、 一般掃描電鏡 目前一般商品掃描電鏡采用熱發(fā)射電子槍,分辯率為60A左右,若采用六棚化鑭電子槍,分辨率可提高到40-50A。 這種電鏡在生物醫(yī)學中的應用也已相當普及。,一、概 述,53,一、概 述,54,一、概 述,55,（四）掃描透射電鏡 掃描電鏡中電子射線作用于樣品后,其中一部分電

13、子可透過樣品成為透射電子,將透過樣品的透射電子和散射電子用檢測器接收成像,即成為掃描透射電鏡。 這種電鏡一般用場發(fā)射電子槍,兼有透射電鏡、掃描電鏡和分析電鏡的特點,能觀察較厚的樣品,分辨本領和成象質量都很好,是近年來電鏡技術的最大改進之一。,一、概 述,56,1、超薄切片技術 由于電子射線穿透本領很差,對厚于0.1微米的切片就很難透過。因此,必須把生物標本切得很薄才能在透射電鏡下觀察。 超薄切片技術就是通過固定

14、、脫水、包埋、切片和染色等步驟,將生物標本切成薄于0.1微米超薄切片的樣品制備技術,用于生物組織的內部超微結構研究。 超薄切片技術是所有電鏡生物樣品制備技術中最常用、最基本的一種技術。,（一）與透射電鏡有關的電子顯微術,57,2、負染色技術 利用電子密度比標本高的重金屬鹽（如磷鴿酸納、醋酸鈾等）將生物標本包圍起來,增強背景散射電子的能力以提高反差,在黑暗的背景下顯示標本的形態(tài)結構,稱負染色技術。 這一技術操作簡便

15、,主要用于顆粒狀標本（如細菌、病毒、分離細胞器等）的研究。,（一）與透射電鏡有關的電子顯微術,58,4、電鏡細胞化學技術 利用各種細胞化學反應,在超微結構水平上研究細胞成分的分布和變化的方法稱電鏡細胞化學技術。 這一技術把細胞超微結構與其化學組成有機地聯系起來,目前主要用于研究細胞內各種大分子物質和酶的定位等。,（一）與透射電鏡有關的電子顯微術,59,5、免疫電鏡技術 這是一種使抗原在超微結構水平上定位的技術,應

16、用與抗原相應的標記抗體,在電鏡下觀察標記物的位置,從而定位相應抗原。 這一技術有靈敏度高、特異性強的特點。,（一）與透射電鏡有關的電子顯微術,60,1、表面觀察樣品制備技術 掃描電鏡適合于研究生物樣品的表面特征,樣品制備包括觀察面暴露、固定、干燥和導電等步驟,使表面特征充分暴露而不變形。 這一技術是掃描電鏡樣品制備的常規(guī)技術,主要用于組織、細胞、寄生蟲等表面形貌的研究。,（二）與掃描電鏡有關的電子顯微術,61,2

17、、生物標本割裂技術 將生物標本放在特殊包埋劑中經冷凍或其他方法國化,然后把固化的標本割裂,暴露組織和細胞的內部結構,再經干燥和導電后在掃描電鏡下觀察。 這一技術使掃描電鏡能觀察生物標本的內部結構,目前最常用的是冷凍割裂技術。,（二）與掃描電鏡有關的電子顯微術,62,（一）在細胞和分子生物學方面的應用 電鏡技術有力地推動了細胞生物學的發(fā)展,使許多在光學顯微鏡下長期不能解決的問題找到了答案。 由于電鏡具有很高

18、的分辯率,使人們對細胞結構的認識不斷深入,從光學顯微鏡的顯微結構水平提高到超微結構水平。,三、電鏡技術在生物醫(yī)學上的應用,63,對光鏡下已經發(fā)現的細胞器如線粒體、中心體等的結構和功能,在電鏡下有了新的和更深入的了解； 對光鏡下爭論不休的細胞器如高爾基體,在電鏡下得到了證實并作了深入的研究； 在電鏡下發(fā)現了很多新的細胞器和結構,如內質網、微體、微管、微絲等；電鏡技術還對細胞的膜系統(tǒng)、細胞骨架和細胞聯結的研究起著重要作用。

19、 采用多種電子顯微術相結合,使人們能夠對細胞各部分的結構、代謝和功能聯系起來進行動態(tài)的研究,從而極大地豐富了細胞生物學的內容。,三、電鏡技術在生物醫(yī)學上的應用,64,（二）在解剖學中的應用 對人體結構的認識是醫(yī)學的重要基礎,而這一種認識是隨著技術的發(fā)展而不斷深入的。 光學顯微鏡的出現使解剖學在大體解剖的基礎上發(fā)展了顯微解剖學（組織學）, 電子顯微鏡的出現則進一步發(fā)展了超微解剖學, 使人們對人體的認識達到了超

20、微結構水平。,三、電鏡技術在生物醫(yī)學上的應用,65,（三）在微生物學中的應用 電鏡技術在微生物學中的應用主要包括兩個方面： 對光學顯微鏡下看得見的原蟲、真菌、細菌等作進一步的超微結構研究； 對病毒的研究?，F以病毒研究為例,說明電鏡技術在微生物學中的應用。,三、電鏡技術在生物醫(yī)學上的應用,66,（四）在病理研究和臨床診斷方面的應用 傳統(tǒng)的病理學在疾病診斷上起著重要作用,但由于醫(yī)學已發(fā)展到分子水平,原布的病理

21、學知識已不能滿足需要。近年來,隨著電鏡技術的發(fā)展,超微結構病理學和超微結構診斷學取得了很大的進展,有效地應用于病因研究和臨床診斷上。,三、電鏡技術在生物醫(yī)學上的應用,67,一、透射電子顯微鏡原理,透射電子顯微鏡:簡稱“透鏡”,68,透射電子顯微鏡 （transmission electron microscope TEM）,現代電子顯微鏡的基本形式,69,電鏡與光鏡主要區(qū)別,70,透射電子顯微鏡中，物鏡、中間鏡、投影鏡是以積木方式成

22、像，如果電子顯微鏡是三級成像，那么總的放大倍數就是各個透鏡倍率的乘積。 M = M0*Mi*Mp,電磁透鏡的光學性質,71,在光鏡中：光束透過樣品時，由于樣品與光子流的相互作用產生不同程度的吸收、反射、折射和散射，其中主要是樣品各部分對光的吸收特性不同而形成明暗不同的像。吸收光線少的部位，其像明亮，吸收光線多的部位，像黑暗。,電子顯微鏡與光學顯微鏡的區(qū)別,72,在電鏡中：電子射線在幾萬伏的加速電壓作

23、用下，以極高的速度聚到樣品上，高速的電子與樣品中的原子發(fā)生碰撞，從而產生散射現象。 由于標本中各部分結構的厚度和密度不同，電子束受阻和產生散射情況也不同，因此透過標本的電子束就有疏密的區(qū)別，射到熒光屏上就會出現明暗不同的影像。,第二節(jié)：透射電子顯微鏡,73,電子束投射到樣品時，可隨組織構成成分的密度不同而發(fā)生相應的電子發(fā)射，如電子束投射到質量大的結構時，電子被散射的多，因此投射到熒光屏上的電子少而呈暗像，電子照片上則呈黑色。

24、稱電子密度高（electron dense）。反之，則稱為電子密度低（electron lucent）。,74,樣品中各部分質量厚度的差異會引起不同的散射，當均勻的電子束穿過樣品時就受到樣品上信息的處理，變成一束疏密相間的電子束。散射角度較大的電子在通過物鏡光欄是就被去除了。 在生物樣品中細胞和組織主要由較輕的低原子序數的原子如碳、氫、氧、氮等組成，這些原子的電子散射能力很小。,電鏡成象的原理,75,成像電子通過

25、樣品時，所碰到的原子數目越多，散射的可能性就越大。散射量和樣品的厚度成正比。 原子核的大小和原子序數直接有關，就是和樣品本身的密度有關。 原子核越大，它帶的正電越多，則核周圍電子云中的電子也就越多，這樣散射的機率就越大。,電鏡成象的原理,76,透射電鏡是以電子束透過樣品經過聚焦與放大后所產生的物像， 投射到熒光屏上或照相底片上進行觀察。分辨率為0.1～0.2nm，放大倍數為幾萬～幾十萬倍。 由于電子易散射或被物體

26、吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50～100nm）。并用重金屬鹽如檸檬酸鉛和醋酸鈾等染色。,透射電鏡原理,77,由于物體上不同部位的結構不同，它們散射電子的能力也各不相同，結果使透過樣品的電子束發(fā)生疏密的差別。 在散射電子能力強的地方，透過去的電子數目就少，因而打在熒光屏上所發(fā)出的光就弱，顯現為暗區(qū)； 而散射電子弱的地方，透過的電子數目多，打在熒光屏上所發(fā)出的光就強，顯現為亮區(qū)。 這樣便在終像上造

27、成了有亮有暗的區(qū)域，因而出現了反差，人眼就可以辨別。,電鏡成象的原理,78,由于電子的穿透力很弱，唯有在高真空條件下才可能達到一定的自由行程，故電鏡鏡筒必須保持高真空（10-4乇以上），樣品必須很薄，一般在100KV加速電壓時，樣品厚度不應超過0.1微米。 電子束對人眼不能引起視覺反應，但可激發(fā)熒光物質產生熒光，故電鏡的觀察部份設有熒光屏。,電子束和電磁透鏡,79,樣品被切成菲薄的切片，質量厚度很小，電子散射能力很弱，因而反差很

28、低，所以必須增加生物樣品的相對散射能力。 在樣品制備過程中要用重金屬進行染色，以提高樣品的散射能力。,電鏡成象的原理,80,一、電子束和電磁透鏡,81,透射電子顯微鏡具有和光學顯微鏡相似結構系統(tǒng)，不同的是：1、用電子射線代替了照明的光線， 2、用電磁透鏡代替光學顯微鏡的聚光鏡、物鏡和目鏡，3、用熒光屏代替肉眼直接觀察，4、使用了極短的電子波，能獲得極高的分辨本領。5、結構復雜。,2、透射電子顯微鏡的結構,82,第二節(jié)

29、：透射電子顯微鏡,透射電鏡內部結構,83,電子顯微鏡的鏡筒內部要求高度真空，并且要有一整套的供電系統(tǒng)。,84,第二節(jié)：透射電子顯微鏡,真空泵管路,85,一、電子束和電磁透鏡,第二節(jié)：透射電子顯微鏡,86,電子顯微鏡是利用電子射線即電子束作光源使物體成像， 要了解電子顯微鏡的原理，首先就要了解電子射線的特性。,一、電子束和電磁透鏡,87,電子束實際上是一種陰極射線，是帶負電荷的粒子，它和其它的光線一樣，具有雙重性:1、具有波動性

30、，2、具有粒子性。,一、電子束和電磁透鏡,88,1924年，De Broglie證明粒子在高速運動的時候會發(fā)射出一定波長的電磁輻射，它的波長用公式表示為： λ是代表波長； h 是Planck（普郎克）常數； m 是粒子的質量； v 是粒子運動的速度。,一、電子束和電磁透鏡,89,如果高速運動的粒子是電子，那么，電子在真空中運動的速度與加速電壓有關，根據能量守恒定律: e是電

31、子的電荷絕對值， V是加速電壓(KV),一、電子束和電磁透鏡,90,從上述式中可以算出電子的速度為: 由于電子的質量m約為質子e的1/1840，把m，v都代入公式，公式可改寫成:,一、電子束和電磁透鏡,91,根據上述公式： 當V= 50KV的時候，λ=0.053埃， 當V=100KV的時候，λ=0.037埃?？梢?，加速電壓越高， 電子束的波長越短?，F將由上式計算得出的電子束波長值列入附表：,一、電子

32、束和電磁透鏡,,92,加速電壓（kV）1.05.010.025.050.075.0100.0300.0500.01000.03000.0,電子束波長(λ)0.3870.1730.1220.0770.0530.0440.0370.0220.0170.0120.007,加速電壓與波長的關系,一、電子束和電磁透鏡,93,電子是帶負電荷的粒子，其運動方式不同于光，

33、電子的運動主要受所處磁場和電場強度的影響，而改變其行進方向。 德國物理學家Busch早在1926年即已指出:“具有軸對稱性的磁場對電子束說來起著透鏡的作用”。他從理論上奠定了可利用磁場作為電子透鏡的基礎。,一、電子束和電磁透鏡,94,什么是電磁透鏡？,能使電子束聚焦的裝置稱為電磁透鏡（electron lens）電磁透鏡是一種焦距(或放大倍數)可調的會聚透鏡。改變激磁電流，電磁透鏡可使電子束會聚。,電磁透鏡結構示意圖,95,電鏡

34、的電磁透鏡在線圈外包有軟鐵的屏蔽外殼，線圈內側多數裝有高精度加工的鐵鈷合金極靴，極靴的作用是使形成的高強度磁場盡可能集中在沿軸的-個很窄的范圍內。 極靴的形狀直接影響成象質量，所以，極靴(特別是物鏡成像極靴)是電子顯微鏡中最重要的部件。,一、電子束和電磁透鏡,96,電子在軸對稱磁場作用下的行為與光學透鏡一樣，也服從幾何光學定律，磁透鏡的焦距可以用光學透鏡的公式計算出。 透鏡焦距和所采用的磁場強度有關，磁場越強，焦距越短，

35、放大倍數也就越高?，F代電子顯微鏡的成像物鏡大多數采用短焦距的強磁透鏡。,一、電子束和電磁透鏡,97,當線圈中通以電流時，線圈周圍形成磁場，從線圈中心軸某一點發(fā)出的電子，在磁場中沿螺旋線軌跡前進，然后會聚在中心軸的其它一點上。 電子束來說，磁場起著透鏡的作用，有聚焦的特性，故稱之為“電磁透鏡”。,一、電子束和電磁透鏡,98,電子束和電磁透鏡的關系,99,一、電子束和電磁透鏡,100,一、電子束和電磁透鏡,101,在理想的情況下，電

36、鏡中的物鏡、中間鏡和投射鏡可以利用光學中透鏡成像公式，與光學的簡單作圖法相似：,一、電子束和電磁透鏡,102,1、球面象差及畸變2、衍射象差3、色差4、象散5、景深6、焦深7、磁滯8、反差與成像,電磁透鏡的特性,103,二、電鏡成象的原理,1-1、球面象差,104,二、電鏡成象的原理,1-2、畸變,105,二、電鏡成象的原理,4、象散,106,二、電鏡成象的原理,5、景深,107,二、電鏡成象的原理,6、焦深,108,普通

37、光學顯微鏡以互不作用的光子流——可見光為照明源，當光線透過樣品組織結構部分時，產生不同程度的吸收、反射、折射和散射，從而形成明暗不同的組織結構影像。 吸收產生振幅差即強度差（反差），肉眼對此最為敏感，它是光學顯微鏡成像中最重要的因素。,二、電鏡成象的原理,109,電鏡是以電子束為照射源，當由熱陰極發(fā)射的電子，在幾十到幾百萬伏電壓作用下，經電子聚光鏡聚焦成電子束，以較高的速度投射到樣品上，并和樣品中的原子發(fā)生碰撞產生了一系列的現象

38、，形成了反差。,二、電鏡成象的原理,110,任何一個物體都是由原子組成的，原子則是由原子核與軌道電子(電子云)組成的。 原子與原子的間距，比原子核或電子本身的大小要長幾百萬倍。,二、電鏡成象的原理,111,對于電子來說，物體就好象是一個實體，它在空間的分布是非常稀疏的。當電子束照射在樣品上的時候，大部份電子都能從原子與原子之間的空隙中穿透過去，而只有極少一部分的電子會與原子的原子核或原子軌道電子發(fā)生碰撞。,二、電鏡成象的原理,1

39、12,二、電鏡成象的原理,113,如果電子是和原子核發(fā)生碰撞，電子基本上不損失能量，而只是改變運動方向，這種碰撞稱為彈性碰撞，此電子發(fā)生了“彈性散射”作用。 如果電子是和軌道電子碰撞，電子不僅會改變原來運動的方向，而且還會損失一部分能量，這種碰撞稱為非彈性碰撞，此電子發(fā)生了“非彈性散射”作用。,二、電鏡成象的原理,114,二、電鏡成象的原理,115,三、電鏡的主要構成部件及性能,第二節(jié)：透射電子顯微鏡,116,透射式電鏡主要由三

40、大部分組成：第一部分:電子光學系統(tǒng)第二部分:真空系統(tǒng)第三部分:供電系統(tǒng),117,電鏡的主要構成部件及性能,118,照明系統(tǒng) 電子槍 聚光鏡

41、 樣品室 成像系統(tǒng) 物 鏡1、電子光學照明系統(tǒng) 中間鏡

42、 投影鏡 觀察室

43、 觀察與記錄系統(tǒng) 照相室 自動曝光裝置,,,,,（第一部分）,119,機械泵油擴散泵管道及自動閥門系統(tǒng)冷阱，預抽室，真空干燥器真空檢測系統(tǒng),,（第二部分）,2、真空系統(tǒng),120,交直流電源高壓電源 透鏡

44、電源真空電源與自動控制系統(tǒng)束偏轉，消散器等電源及控制系統(tǒng)安全系統(tǒng)和輔助電源,3、電子學系統(tǒng),,第三部分,121,JEOL JEM100CX-II透射電鏡,122,123,124,125,一、電子光學系統(tǒng),126,一、電子光學系統(tǒng) 電子光學系統(tǒng)即電鏡的鏡體，它基本上是一個電子透鏡系統(tǒng)，一端是電子源，另一端是觀查和記錄系統(tǒng)，中間是安放樣品的裝置。其結構示意圖見圖1—18所示。分述如下：,127,透射電子顯微鏡的結構,1． 陰極

45、組件2． 陽極3． 第一聚光鏡4． 第二聚光鏡5． 聚光鏡可動光欄6． 第二聚光鏡消散器7. 擺動器8． 樣品架9． 物鏡可動光欄10．物鏡消散器11．物鏡12．視野光欄13．第一中間鏡14．第二中間鏡15．投影鏡16．雙目顯微鏡17. 快門18．觀察窗19．熒光屏20．照相室21．底片暗盒,128,1．照明系統(tǒng) 照明系統(tǒng)是由電子槍和聚光鏡組成。其作用是為成像系統(tǒng)提供一個亮度高，

46、尺寸小、高穩(wěn)定的照明電于束。電子束的亮度由電子發(fā)射強度決定，束斑大小主要由聚光鏡的性能決定。,129,（1）電子槍： 它是電鏡的照明源，其重要性僅次于物鏡。因為電鏡的放大率很高，而終像的亮度是電子透過樣品后亮度的1／M2倍（M是電鏡總放大率）。而且電鏡的孔徑角很小，因此，要求電子槍能產生很亮(即單位立體角的電流密度很高)的細電子束。 電子槍由燈絲陰極、柵極(或稱韋氏圓筒)和加速陽極組成，參閱圖1-19。,130,131,

47、燈絲是用0.1毫米的鎢絲做成V字形，通電加熱至2,500-2,800K時，在尖端即產生熱電子發(fā)射，形成照明束。在燈絲下方有一加速電極——陽極，用來加速電子。 電壓通常在50-100kV(千伏)之間。為了防止產生色差，加速電壓要求高度穩(wěn)定，其穩(wěn)定度通常要求達到10-6/分的數量級。 在燈絲和陽極之間有一電位比陰極要負（-100—-500V)的柵極。,132,柵極用于控制電子束形狀和發(fā)射強度?，F代電鏡一般采用自給柵偏電子槍（

48、圖1-20）。把負高壓接到柵板上，經過一個可變電阻(棚偏壓電阻)接到燈絲上。 其優(yōu)點是柵偏壓電阻起負反饋作用，從而能穩(wěn)定電子束流的作用；圖1-20表明自偏壓電子槍電子發(fā)射的示意圖。由于柵極的排斥作用，使電子會聚成束。其中束交叉點處束徑小于100μ，電子密度最高，是電鏡的實際電子源。,133,134,在開始時，隨著燈絲加熱電流增大，燈絲溫度上升，束流也增加，但由于柵偏壓電阻的反饋作用，束流增長逐漸變慢，當燈溫度到達某值時，束流不再

49、隨燈絲溫度的上升而增大，此稱為束流的飽和點。 柵偏壓電阻值不同有不同的飽和點。飽和現象使束流穩(wěn)定從而穩(wěn)定了終像的亮度。 如果調節(jié)加熱電流使之比飽和點稍小一點，此時屏上出現如圖1-21的圖像。,135,燈絲像，中心亮斑是燈絲尖的像，顯出制造燈絲時鎢絲的拉線，周圍的“暈輪”是柵極帽的像。此燈絲像在電鏡調整中很有用。,136,（2）聚光鏡 聚光鏡的作用是將來自電子槍的電子會聚到樣品上，通過它來控制照明電子

50、束斑大小，電流密度和孔徑角。 照明束斑過大時，會引起樣品熱漂移和污染，使圖像模糊不清，并會因電流密度不足而使像亮度差，故電鏡多有兩個聚光鏡。 第一聚光鏡（C1）是一個強透鏡，它的作用是把有效光源的尺寸縮小，即縮小束斑直徑，最小可達1-2μ。,137,第二聚光鏡（C2）是一個弱透鏡，采用長焦距的弱透鏡是為了使照明孔徑角足夠小和在聚光鏡與物鏡之間提供一個較大的樣品空間，以便能夠放進樣品臺以及其它的附件。 第二聚光鏡用

51、以控制照明亮度、照明孔徑角和照明斑的尺寸，但只能在第一聚光鏡決定的范圍內變化照明斑的大小。,138,實際操作中在像的亮度足夠的條件下，第二聚光鏡盡可能散焦，以獲得盡可能小的孔徑角（孔徑角增大，球差增大）。 為了縮小照明孔徑角，在第二聚光鏡之下裝有第二聚光鏡可動光欄（φ100、300、400微米的圓孔)，根據需要可選取不同的光欄孔。 第二聚光鏡如存在像散，亮斑成橢圓將會降低終像的亮度。第二聚光鏡都裝備有消散器。,139,電

52、子槍和聚光鏡（C1和C2）都裝備有平移和傾斜的調整機構（機械式的或電磁式的），以進行相互之間或與物鏡之間進行合軸調整。,140,2．成像系統(tǒng) 成像系統(tǒng)包括樣品室、物鏡、中間鏡和投射鏡（或有兩個中間鏡，或有兩個投射鏡構成4-5個透鏡系統(tǒng)）。（1）樣品室 第二聚光鏡下面是樣品室。室內有樣品臺，樣品臺支承樣品并使樣品可在兩個相互垂直的方向移動。移動是極端精密的，在高倍放大時，重復精度應達到±100A以內。多

53、數電鏡的樣品臺還裝有使樣品旋轉和傾斜的裝置。,141,電鏡的樣品載于銅網上，銅網放在樣品架（或稱樣品筒）上。 樣品架如從上向下落入物鏡中，稱為頂落式。頂落式由于穩(wěn)定性較好，能獲得較高分辨率。 樣品架如從側面插進物鏡中稱側插式。側插式樣品架便于樣品傾斜，旋轉等，適用于分析性電鏡。,142,高性能的電鏡，在樣品室中常裝有防污染裝置。電鏡鏡簡的真空度常在10-5- 10-6乇，多是采用油擴散泵來獲得高真空。由于擴散泵油和密封橡

54、皮墊圈的真空脂的揮發(fā)，使鏡筒內含有大量的碳化氫分子。這些碳化氫分子落到樣品表面上形成無定形的覆蓋層，它使樣品的反差降低。這個覆蓋層受到電子束的轟擊時會分解為碳和氫。氫氣進入真空中，而碳則留在樣品上。這種現象稱為“污染”。,143,在一些臟的鏡簡中，“污染”引起的碳的沉積層可達每秒5A的速度生長。“污染”層與樣品一起成像顯著降低分辨本領。因此，需要防污染裝置。 它是一塊盡可能靠近樣品的冷凍金屬塊。通常用金屬銅制成，中央有一小孔以便

55、電子能正常通過。銅片放在樣品上方或下方，或者上下方各放一塊。,144,銅片連接銅棒，銅棒經過真空密封通到鏡簡外，浸在充滿液氮的杜瓦瓶中。熱量通過銅棒迅速傳走，使銅片保持在-150℃溫度。于是碳化氫分子首先凝集在冷卻的銅片表面上，從而防止這些碳化氫分子去“污染”樣品。,145,（2）物鏡： 在樣品室下面是物鏡。其作用有二種：形成樣品的第一級放大像和通過調節(jié)物鏡線圈的激勵電流，相應地改變物鏡的焦距從而對像進行聚焦。 物鏡是電

56、鏡的最關鍵部分，由它獲得第一幅具有一定分辨本領的電子放大像，物鏡中任何缺陷都將被成像系統(tǒng)其它透鏡進一步放大。 電鏡的分辨本領主要取決于物鏡的分辨本領。,146,為了減少像差從而提高分辨本領，物鏡應是強激勵短焦距的。高性能電鏡的物鏡最短焦距約為1-2毫米，放大率約為100—200倍，分辨本領約達2埃。 為了減少色差，要求激勵電流高度穩(wěn)定，常要求達1×10-6／分鐘。 在電鏡觀察中，像的漂移是一個很討

57、厭的現象。,147,其原因有熱漂移或樣品臺的機械振動。熱漂移是來自電子束的能量引起樣品的溫升和物鏡激勵電流產生的溫升。為了減少物鏡溫升引起的熱漂移，通常用水冷卻物鏡，使其保持恒溫。這些冷卻水管很細，并要注意冷卻水的水質。 物鏡中都裝備有一可動光欄，它是由非磁金屬如鉑或鉬制成，一般有3-4個大小不同的孔供選擇。,148,物鏡光欄除能提高像的反差外，還起控制物鏡孔徑角的作用：通常樣品是放在物鏡的前焦面附近，而物鏡光欄放在物鏡的后焦面

58、附近，物鏡孔徑角在焦距變化不大時，近似為光欄孔半徑（R）與物鏡焦距（f）之比，即α≈R/f 。 選擇合適的孔徑角是重要的，它對提高分辨本領和像反差有明顯的影響。,149,物鏡下面都裝備有一物鏡消散器，以最大限度減少物鏡像散，以獲得高的分辨本領。（3）中間鏡和投射鏡。 中間鏡的作用是把物鏡形成的一次放大像或衍射花樣投射到投射鏡的物平面上，再由投射鏡放大投射到螢光屏上而獲得終像。中間鏡是一個可變倍率的弱透鏡，焦距較長，放大

59、率在20倍之內。,150,電鏡總放大倍率的改變主要利用中間鏡倍率的變化來達到，電鏡的總放大率為所有透鏡放大率之積，即； M總=M0× M1× MPM0-物鏡放大率； M1-中間鏡放大率； MP-投射鏡放大率。 投射鏡的作用是把中間鏡形成的二級放大像再放大投射到螢光屏上，從而形成終像。,151,投射鏡是一個短焦距的強磁透鏡。投射鏡因為是作第三次放大，故對它的精度要求較低。 投射鏡

60、的像差主要表現在低放大倍數時的畸變。此時成像電子束通過透鏡面積較大。一般是利用中間鏡形成的“桶形畸變”和投射鏡形成的“枕形畸變”互相抵消，從而獲得無畸變的低放大率的像。,152,同樣在成像系統(tǒng)中也必須備有一個重要的合軸機構。3、像的觀察和記錄系統(tǒng) 在投射鏡下面是像的觀察和記錄系統(tǒng)，終像是用螢光屏來顯示。 除了用于觀察的大螢光屏外，還有一個用于聚焦的小螢光屏和放大10倍的長焦距的雙目光學顯微鏡。,153,光

61、學顯微鏡由于使用很大的物鏡孔徑角，使用它放大時像的亮度損失很小。而使用直接增大電子光學放大倍數獲得高放大倍數時，像的亮度會顯著下降，這是使用光學顯微鏡的優(yōu)點和設置它的原因。 聚焦螢光屏可以傾斜，以利通過光學顯微鏡進行聚焦。,154,在螢光屏下面是照相暗盒，它和電磁快門、曝光表組成像的記錄系統(tǒng)，用于把終像拍攝記錄下來。 把終像拍攝下來不但能把像長期保留以便研究分析，而且由于照相底片的分辨本領大大高于螢光屏，因此，拍攝出來的

62、底片往往含有在螢光屏直接觀察中看不到的細節(jié)。,155,在拍攝使用曝光表要注意：曝光表所反映的像的亮度必須能代表整個像的平均亮度，否則所拍攝得的像不能獲得滿意的結果。 多數的電鏡中，照相室和觀察室之問都裝備有單獨的氣閥，使照相室可單獨徘氣和放氣，以便更換底片時不會破壞整個鏡簡的真空，并且可繼續(xù)進行像的觀察。,156,2、真空系統(tǒng),157,真空系統(tǒng)和電子學系統(tǒng)都是為了保證電子光學系統(tǒng)正常工作的輔助系統(tǒng)。1、真空系統(tǒng)—— 真空是

63、指完全沒有任何物質的空間，也就是說這個空間內的氣壓為零的。這樣的空間稱為“絕對真空”。 通常我們所講的真空是指它里面的氣壓少于常壓的空間。,158,一個空間的真空程度與它的氣壓是密切相關。氣壓越接近常壓——大氣壓的空間的真空度就越低，反之氣壓越低，則真空度就越高。 真空度用氣壓表示。 一個大氣壓=760毫米水銀柱的壓力。國際上用“乇” （Torr）表示即： 1乇=1毫米水銀柱壓力=1/760大氣壓,

64、159,另外也有用“帕”（Pa）表示的：1帕＝1達因／（厘米）=7×10-3乇通常把不同程度的低氣壓空間劃分為：760乇-10乇 粗真空10乇- 10-3乇 低真空10-3乇-10-8乇 高真空10-8乇以下 超高真空,160,電鏡的真空系統(tǒng)——是用于從鏡筒中排除空氣和其它氣體， 鏡筒內有較高的氣壓時就會發(fā)

65、生：①氣體分子與高速電子碰撞而散射電子；這樣會引起“炫光”或降低像的反差。②電子槍的負高壓會引起電離和放電，使電子束不穩(wěn)定或“閃爍”。②殘余氣體與熾熱的燈絲作用，不斷腐蝕燈絲，縮短其壽命。④殘余氣體會污染樣品。,161,電鏡的真空系統(tǒng)一般包括：1、真空泵（機械泵和擴散泵）、2、真空指示器、3、真空管道和自動閥門系統(tǒng)；4、冷阱、預抽室、真空干燥器；5、用于開關氣動閥門的空氣壓縮機等。 （一）、電鏡鏡簡要求真空度一

66、般約為10-5乇，常采用兩級真空泵：,162,第一級：是機械泵獲得10-1- 10-2乇的低真空，作為第二級泵的預真空；第二級：采用油擴散泵使真空到達10-5乇。 對于要求真空度高于10-5乇的電鏡，往往需要三級串聯系統(tǒng)，第三級：多采用吸附泵或油擴散泵，泵系統(tǒng)通過真空管道和閥門與鏡筒連接，,163,一般真空管道短而粗——以盡可能減少氣阻獲得最大的抽速。 管道表面光滑——防止金屬表面吸附氣體后放氣而影響真空度。

67、 真空管道，閥門等的接口——均采用橡膠墊圈（O環(huán)）來密封， O環(huán)抹上一些真空脂提高密封效果，但不宜過多，以防止真空脂揮發(fā)而污染鏡筒的真空。,164,對于真空度高于10-5乇的真空系統(tǒng)，都用金屬墊圈或非橡膠墊圈來密封。即電子槍附近的接口用的O環(huán)不能用真空脂。 （二）、電鏡的真空指示器（常稱為真空規(guī)）是用來檢測和監(jiān)視鏡簡的真空狀態(tài)的，一般的真空規(guī)都是只適用于測量某一段的真空度的，因此，電鏡常用二個真空規(guī)：,165,（1）用于測量真

68、空度在10-3以下的低真空規(guī)，與機械泵相對應。常用的有熱傳導式的“皮拉尼” （PIRANI）真空規(guī)，（2）用于測量真空度在10-3 -10-7的高真空規(guī)、常用的是冷電離型的“潘寧”（PENNING）規(guī)。 在理想的情況下，泵系統(tǒng)把鏡筒的氣體排除出去使達到要求的真空度后，就可密封鏡筒并把泵關閉，但是這不可能做到——,166,產生的原因： 氣體會不斷地通過一些很小的漏氣孔進入鏡筒，同時鏡筒內壁表面，尤其是照相底片會不斷放出氣