發(fā)酵工藝學(xué)講稿

1、《發(fā)酵工藝學(xué)》,倪孟祥 張艷鋒 　 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物制藥教研室Email:nimx_2000@aliyun.comwechat：xiangm20132016.2,,一、教材： 夏煥章 主編 《發(fā)酵工 藝學(xué)》,二、參考書(shū)以及文獻(xiàn)：生物工藝學(xué)：儲(chǔ)炬主編。生物工程學(xué)報(bào)食品與發(fā)酵工業(yè)中國(guó)抗生素雜志微生物學(xué)學(xué)報(bào)應(yīng)用微生物學(xué)雜志Bioengin

2、eering and Biotechnology,第一章 緒論一、生物技術(shù)與生物工程1 生物技術(shù)（Biotechnology）------是應(yīng)用自然科學(xué)以及工程學(xué)的原理，依靠生物作用劑（biological agents） 的作用將物料進(jìn)行加工，以提供產(chǎn)品或?yàn)樯鐣?huì)服務(wù)的技術(shù)。------是將生物化學(xué)、生物學(xué)、微生物學(xué)和化學(xué)工程應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程（包括醫(yī)藥衛(wèi)生、能源及農(nóng)業(yè)的產(chǎn)品）以及環(huán)境保護(hù)的技術(shù)。------是對(duì)生物作用

3、和生物物料加以評(píng)價(jià)和應(yīng)用，并進(jìn)行工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)的技術(shù)。------是生物系統(tǒng)或生物過(guò)程的工業(yè)利用。,特點(diǎn)：（1）多學(xué)科、綜合性的科學(xué)技術(shù)（2）有生物催化劑的參與 目的：是建立工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程或進(jìn)行社會(huì)服務(wù)。 生物技術(shù)的多學(xué)科性生物學(xué)、化學(xué)、工程學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、農(nóng)學(xué)等。,,2 生物工程（bioengineering）一般是指醫(yī)學(xué)工程、環(huán)境工程、衛(wèi)生工程、農(nóng)業(yè)工程、仿生工程、人體功能工程等的總稱(chēng)。物理過(guò)程與生物學(xué)的結(jié)合

4、。,3 生物化學(xué)工程（biochemical engineering）運(yùn)用化學(xué)工程的原理和方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室所取得的生物技術(shù)成果加以開(kāi)發(fā)，使之成為生物反應(yīng)過(guò)程的一門(mén)學(xué)科。,生物技術(shù)工程,基因工程,酶工程,細(xì)胞工程,發(fā)酵工程,產(chǎn)物,產(chǎn)品,,,,,,,產(chǎn)品,,發(fā) 酵 工 程 ── 利用微生物進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn),,抗生素、生物制藥、氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸、飼料添加劑、微生

5、態(tài)制劑、生物農(nóng)藥、生物肥料等,,醫(yī)藥、輕工、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、能源等行業(yè),基因工程藥物、疫苗及抗體產(chǎn)品,,化學(xué)工程 生物化工 生物加工行業(yè),傳統(tǒng)生物技術(shù),現(xiàn)代生物技術(shù)基因工程菌發(fā)酵,,二、生物反應(yīng)過(guò)程的特點(diǎn)生物反應(yīng)過(guò)程：（1）原材料的預(yù)處理 （2）生物催化劑的制備 (3 ) 生物反應(yīng)器及反應(yīng)條件

6、 的選擇 （4） 產(chǎn)物的分離純化特點(diǎn) （1）常溫、常壓 （2）原料來(lái)源豐富、價(jià)廉 （3) 生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單 (4) 酶反應(yīng)過(guò)程和發(fā)酵過(guò)程各具特 點(diǎn)。,三、生物技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史1 傳統(tǒng)（

7、古老）的生物技術(shù)2 第一代（初期）生物技術(shù)產(chǎn)品的出現(xiàn)：19世紀(jì)末--------20世紀(jì)30年代3 第二代（近代）生物技術(shù)產(chǎn)品的發(fā)展：20世紀(jì)40年代4 第三代（現(xiàn)代）生物技術(shù)產(chǎn)品的出現(xiàn),,,,簡(jiǎn)歷亞歷山大·弗萊明（Alexander Fleming，1881.8.6 - 1955.3.11），英國(guó)微生物學(xué)家。1881年8月6日出生于蘇格蘭基馬爾諾克附近的洛克菲爾德。13歲時(shí)隨其兄（開(kāi)業(yè)醫(yī)師）去倫敦

8、做工，由于意外地得到姑父的一筆遺產(chǎn)，進(jìn)入倫敦大學(xué)圣瑪麗醫(yī)學(xué)院學(xué)習(xí)，1906年畢業(yè)后留在母校的研究室，幫助其師賴(lài)特博士進(jìn)行免疫學(xué)研究。1918年弗萊明返回圣瑪麗醫(yī)學(xué)院，加緊進(jìn)行細(xì)菌的研究工作。1922年他發(fā)現(xiàn)了一種叫“溶菌酶”的物質(zhì)，發(fā)表了《皮膚組織和分泌物中所發(fā)現(xiàn)的奇特細(xì)菌》的報(bào)告。1929年弗萊明在《不列顛實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志》上，發(fā)表了《關(guān)于霉菌培養(yǎng)的殺菌作用》的研究論文，但未被人們引起注意。弗萊明指出，青霉素將會(huì)有重要的用途，但他自

9、己無(wú)法發(fā)明一種提純青霉素的技術(shù)，致使此藥十幾年一直未得以使用。1939年，在英國(guó)的澳大利亞人瓦爾特·弗洛里（1898—1968）和德國(guó)出生的鮑利斯·錢(qián)恩（1906—1979），重復(fù)了弗萊明的工作，證實(shí)了他的結(jié)果，然后提純了青霉素，1941年給病人使用成功。在英美政府的鼓勵(lì)下，很快找到大規(guī)模生產(chǎn)青霉素的方法，1944年英美公開(kāi)在醫(yī)療中使用，1945年以后，青霉素遍及全世界。1945年，弗萊明、弗洛里和錢(qián)恩共獲諾貝爾生

10、理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。簽名簽名1943年弗萊明成為英國(guó)皇家學(xué)會(huì)院士，1944年被賜于爵士。1915年弗萊明結(jié)婚，兒子是個(gè)普通的醫(yī)生，夫人于1949年去世。1953年再次結(jié)婚。1955年3月11日與世長(zhǎng)逝，安葬在圣保羅大教堂。匈牙利1981年發(fā)行了弗萊明誕生100周年的紀(jì)念郵票。,,,弗萊明的發(fā)現(xiàn)，至少需有下述三方面的條件作保障。1、來(lái)源不明的青霉菌孢子落入葡萄球菌培養(yǎng)基中。2、弗萊明未將培養(yǎng)基放在37攝氏度的溫箱中，也未清洗，而是

11、放置在室溫下。3、天氣的配合。當(dāng)年的氣溫記錄顯示，恰好在7月28至8月10，倫敦有一段十分難得的涼爽天氣，極其適合青霉菌先行生長(zhǎng)成熟，并產(chǎn)生了青霉素。而8月10號(hào)以后，氣溫則明顯升高有利于葡萄球菌快速生長(zhǎng)，以至于發(fā)生了溶菌現(xiàn)象。4、或許還要加上，在弗萊明剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，尚未著手清洗培養(yǎng)皿時(shí)，其前任助手恰好到來(lái)敘舊。,發(fā)酵現(xiàn)象→釀造食品工業(yè)→非食品工業(yè)→青霉素→抗菌素發(fā)酵工業(yè)→氨基酸,核酸發(fā)酵（代謝控制發(fā)酵）→基因工程菌→動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)

12、模培養(yǎng)→植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)→藻類(lèi)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)→轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,第一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)：非食品工業(yè)第二個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)：青霉素→抗菌素發(fā)酵工業(yè)第三個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)：切斷支路代謝:酶的活力調(diào)控,酶的合成調(diào)控(反饋控制和反饋?zhàn)瓒?,解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié), 突變株的應(yīng)用,前體、終產(chǎn)物、副產(chǎn)物等近代轉(zhuǎn)折點(diǎn)：基因、動(dòng)物、海洋,發(fā)酵工程的重大轉(zhuǎn)折點(diǎn),二十世紀(jì)四十年代初，第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，青霉素的發(fā)現(xiàn)，迅速形成工業(yè)大規(guī)摸生產(chǎn)。1928年由 Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素

13、1941年美國(guó)和英國(guó)合作對(duì)青霉素進(jìn)行生產(chǎn)研究 表面培養(yǎng)：1升扁瓶或錐形瓶，內(nèi)裝200mL麥麩培養(yǎng)基 ─── 40u/ml1943年沉浸培養(yǎng)： 5m3 ─── 200u/ml當(dāng)今：100m3─200m3 ─── 5-10萬(wàn)u/ml 鏈霉素、金霉素、新霉索、紅霉素,,主要的技術(shù)進(jìn)展：通氣攪拌解決了液體深層培養(yǎng)時(shí)的供氧問(wèn)題。抗雜菌污染的純種培養(yǎng)技術(shù)：無(wú)菌空氣、培養(yǎng) 基滅菌、無(wú)污染接種、大型發(fā)酵罐的密封與抗污染設(shè)計(jì)制造。

14、意義：抗生素工業(yè)的發(fā)展建立了一套完整的好氧發(fā)酵技術(shù)，大型攪拌發(fā)酵罐培養(yǎng)方法推動(dòng)了整個(gè)發(fā)酵工業(yè)的深入發(fā)展為現(xiàn)代發(fā)酵工程奠定了基礎(chǔ),大型發(fā)酵罐攪拌裝置,180M3發(fā)酵罐車(chē)間,大型空氣壓縮機(jī),發(fā)酵車(chē)間的空氣過(guò)濾器,,動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器,,20世紀(jì)70年代,細(xì)胞融合技術(shù)、基因操作技術(shù)等生物技術(shù)發(fā)展，打破了生物種間障礙，能定向地制造出新的有用的微生物：增加微生物體內(nèi)控制代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的基因拷貝數(shù)，可以大幅度地提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量將動(dòng)、植物或

15、某些微生物特有產(chǎn)物的控制基因植入細(xì)胞中，快速經(jīng)濟(jì)地大量生產(chǎn)這些產(chǎn)物將具有不同性能的多種質(zhì)粒植入，使新菌株在清除污染或以非糧食物質(zhì)為原料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)或環(huán)境保護(hù),,細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù),細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) ── 微生物、動(dòng)植物細(xì)胞、藻類(lèi)細(xì)胞等細(xì)胞代謝產(chǎn)物、生物轉(zhuǎn)化、酶、基因表達(dá)產(chǎn)物和基因質(zhì)粒等占生物技術(shù)產(chǎn)品的40%以上，達(dá)1OOO億美元。,,,發(fā)酵工程產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,目前，全球發(fā)酵產(chǎn)品的年銷(xiāo)售額在400億美元左右，并以每年約7％～8％的速率增長(zhǎng)

16、。 我國(guó)發(fā)酵行業(yè)生產(chǎn)企業(yè)有5000多家，主要發(fā)酵產(chǎn)品的年產(chǎn)值高達(dá)1300億元。 發(fā)酵工程技術(shù)給人類(lèi)社會(huì)生產(chǎn)力的發(fā)展帶來(lái)了巨大的潛力,涉及到解決人類(lèi)所面臨的食品與營(yíng)養(yǎng)、健康與環(huán)境、資源與能源等重大問(wèn)題,21世紀(jì)是生物技術(shù)世紀(jì),未來(lái)學(xué)家說(shuō)：21世紀(jì)是生物技術(shù)世紀(jì)；科學(xué)家預(yù)言： 21世紀(jì)世界即將在生物技術(shù)上取得重大突破，新世紀(jì)之初，科學(xué)方面的主要將在生物學(xué)、遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)、新型生物材料、能源、環(huán)境保護(hù)上有所突破；經(jīng)濟(jì)學(xué)家則認(rèn)為：21世紀(jì)

17、20年代，生物經(jīng)濟(jì)將由目前的形成階段進(jìn)入成長(zhǎng)階段，即工業(yè)生產(chǎn)與商業(yè)開(kāi)發(fā)階段。,現(xiàn)代生物技術(shù)：以基因工程為主導(dǎo)，發(fā)酵工程為中心，加上酶工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程等的一個(gè)綜合體系。主要包括：重組DNA 技術(shù)、原生質(zhì)體技術(shù)、突變生物合成、組合生物合成、單克隆抗體、組織培養(yǎng)技術(shù)。,具體：開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品、改造現(xiàn)有生產(chǎn)菌種、代謝途徑工程、生物轉(zhuǎn)化、診斷藥物的研制及治療藥物的研制、基因治療、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物等。,四、發(fā)酵以及發(fā)酵

18、工業(yè)的范疇1.發(fā)酵（fermentation）原始定義現(xiàn)代含義： 是指利用培養(yǎng)微生物來(lái)制得產(chǎn)物的需氧或厭氧的任何過(guò)程。,2.發(fā)酵工業(yè)的范疇（1）微生物菌體發(fā)酵（2）微生物酶的生產(chǎn)（3）微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵：初級(jí)代謝產(chǎn)物 和次級(jí)代謝產(chǎn)物（4）微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵（5）工程菌發(fā)酵（6）動(dòng)植物細(xì)胞發(fā)酵,五、發(fā)酵工藝的培養(yǎng)方法和過(guò)程（一） 培養(yǎng)方法：1.表面培養(yǎng)法2.深層培養(yǎng)法（二）

19、生產(chǎn)過(guò)程1.菌種制備2.種子制備3.發(fā) 酵4.下游處理,六、發(fā)酵工業(yè)的現(xiàn)狀及發(fā)展趨向,發(fā)酵工程在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的地位,21世紀(jì)的工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，究竟是一個(gè)什么樣的格局？作為工業(yè)生物技術(shù)核心的發(fā)酵工程，在已經(jīng)開(kāi)始的生物經(jīng)濟(jì)時(shí)代，是處于一種什么狀態(tài)？能起何種作用？又面臨那些課題？這是人們所關(guān)注的問(wèn)題！,小結(jié),1.發(fā)酵的定義，發(fā)酵工業(yè)的范疇2.生物工程和生物技術(shù)的特點(diǎn)3.生物反應(yīng)過(guò)程的 一般特點(diǎn)4.發(fā)酵工程的

20、發(fā)展簡(jiǎn)史5.發(fā)酵過(guò)程的一般方法,本課程的學(xué)習(xí)內(nèi)容,通過(guò)《發(fā)酵工藝學(xué)》的學(xué)習(xí)，將技術(shù)基礎(chǔ)課和專(zhuān)業(yè)課與發(fā)酵工業(yè)的操作原理結(jié)合起來(lái)，了解發(fā)酵工業(yè)控制的特性及共性，并且熟悉發(fā)酵工業(yè)的工藝流程及常用術(shù)語(yǔ)，為今后從事生物技術(shù)的有關(guān)科研和生產(chǎn)打下良好的基礎(chǔ)。,此外，發(fā)酵工程的最基本問(wèn)題是過(guò)程優(yōu)化與放大，通過(guò)本課程的學(xué)習(xí)，對(duì)上述過(guò)程工程問(wèn)題與生物學(xué)基礎(chǔ)有較深入的認(rèn)識(shí)，對(duì)有關(guān)交叉學(xué)科的前沿技術(shù)在發(fā)酵工程中的應(yīng)用有一定的了解。,第二章 微生物藥物生物合成

21、與調(diào)控微生物的3個(gè)重要特點(diǎn)： 1. 比表面積大 2. 及其多樣化的代謝反應(yīng) 3. 容易適應(yīng)多種環(huán)境條件兩類(lèi)代謝產(chǎn)物： 初級(jí)代謝產(chǎn)物 次級(jí)代謝產(chǎn)物,初級(jí)代謝和次級(jí)代謝的關(guān)系：1.生化代謝（1）具有一

22、個(gè)共同的中間體（2）次級(jí)代謝產(chǎn)物很多是以初級(jí)代謝產(chǎn)物為 母體衍生來(lái)的,葡萄糖碳架摻入途徑：鏈霉素、卡那 霉素莽草酸途 徑： 氯霉素、新生霉素與核苷有關(guān)的途 徑： 殺結(jié)核菌素聚酮體和聚丙酸途徑：四環(huán)素、制霉 菌素、灰黃霉素由氨基酸衍

23、生的途徑：青霉素、頭孢 菌素甲羥戊酸途 徑：赤霉素其他復(fù)合途 徑：博雷霉素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi),（3）兩個(gè)代謝途徑中所涉及的酶不完全相同（4）都受到菌體代謝的調(diào)節(jié)，相互交錯(cuò)。2.遺傳代謝（1）都受到核內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA 的調(diào)節(jié)控制（2）次級(jí)代謝產(chǎn)物還受到與初級(jí)代謝產(chǎn)物合 成無(wú)關(guān)的遺傳物質(zhì)的控制。,第

24、一節(jié) 微生物初級(jí)代謝產(chǎn)物的 生物合成與調(diào)控 一、 微生物生物合成的初級(jí)代謝產(chǎn)物二、 初級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成中的主要調(diào)控機(jī) 制代謝調(diào)控的類(lèi)型主要有：酶活性的調(diào)節(jié)，酶合成的調(diào)節(jié)。（一）酶合成的調(diào)節(jié)1. 酶合成的誘導(dǎo)調(diào)節(jié) 組成酶和誘導(dǎo)酶,底物的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物誘導(dǎo) 順序誘導(dǎo) 2. 酶合成的阻遏 降解酶：誘導(dǎo)和分解代謝產(chǎn)物

25、調(diào)節(jié) 合成酶：反饋調(diào)節(jié)（1）分解代謝物調(diào)節(jié)：葡萄糖效應(yīng)（2）反饋?zhàn)瓒簦?單一終產(chǎn)物阻遏、多價(jià)阻 遏、累加阻遏,3.酶合成誘導(dǎo)及阻遏的調(diào)節(jié)機(jī)制： 操縱子學(xué)說(shuō)4.分解代謝產(chǎn)物阻遏機(jī)制,（二）酶活性的調(diào)節(jié) 1.酶活性的激活2.酶活性的抑制包括：競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反饋抑制。,反饋抑制：（1）協(xié)同反饋抑制（2）累積反饋抑制

26、（3）增效反饋抑制（4）順序反饋抑制（5）同功酶調(diào)節(jié),3. 酶活性的調(diào)節(jié)的機(jī)制：調(diào)節(jié)酶學(xué)說(shuō)（變構(gòu)酶學(xué)說(shuō)/別構(gòu)酶學(xué)說(shuō)）（三）能荷調(diào)節(jié)能荷（%）= ×100%三、初級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成中的主要調(diào)控機(jī) 制的實(shí)際應(yīng)用,,第二節(jié) 微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的 生物合成與調(diào)控一、微生物合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物的基本

27、特征1.次級(jí)代謝產(chǎn)物具有種的特異性2.產(chǎn)生菌生長(zhǎng)周期可分為三個(gè)時(shí)期3.次級(jí)代謝產(chǎn)物大多是結(jié)構(gòu)相似的混合物4.次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成受多基因控制,二、次級(jí)代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位前體1.短鏈脂肪酸與聚酮體內(nèi)酯環(huán)（大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)）、四環(huán)類(lèi)、蒽醌環(huán)2.甲羥戊酸赤霉素、生物堿等3.糖類(lèi)和氨基酸大環(huán)內(nèi)酯,4.非蛋白氨基酸D-氨基酸、N-甲基氨基酸、脫氫的和B-氨基酸5.環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇氨基糖苷類(lèi),三、次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的主

28、要調(diào)控機(jī)制（一）酶合成的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)（二）反饋調(diào)節(jié)1.自身反饋調(diào)節(jié)抑制抗生素自身合成需要的抗生素濃度與產(chǎn)生菌的生產(chǎn)能力成正比關(guān)系。2.前體物質(zhì)的自身反饋抑制纈氨酸的反饋?zhàn)饔?.支路產(chǎn)物的反饋抑制賴(lài)氨酸和青霉素的合成,4.次級(jí)代謝產(chǎn)物的自身反饋調(diào)節(jié)（三）磷酸鹽的調(diào)節(jié)0.3~300mmol/L生長(zhǎng)10mmol/L表現(xiàn)出抑制1.促進(jìn)初級(jí)代謝，抑制菌體的次級(jí)代謝2.抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物前體的生物合成3.阻抑次級(jí)代謝中的磷酸

29、酯酶4.ATP 的調(diào)節(jié)5.對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制,（四）碳分解產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用及機(jī)理（五）氮分解產(chǎn)物的調(diào)控1.次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成酶的合成2.銨能調(diào)節(jié)糖代謝中的某些酶的活性3.銨能調(diào)節(jié)某些氨基酸的合成4.銨能調(diào)節(jié)產(chǎn)生菌的淀粉酶和蛋白酶的活性（六）產(chǎn)生菌生長(zhǎng)速率的調(diào)節(jié)（七）溶解氧的調(diào)節(jié)作用,小結(jié),1.基本概念2.酶調(diào)節(jié)的機(jī)制3.次級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)的特點(diǎn)。,第三章 工業(yè)微生物的菌種選育,利用工業(yè)微生物發(fā)酵生產(chǎn)的過(guò)

30、程中，決定生產(chǎn)水平高低最主要的有三個(gè)方面的因素：生產(chǎn)菌種，發(fā)酵工藝和后提取工藝。其中最重要的是生產(chǎn)菌種。菌種選育的最初目的是改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。,菌種選育的目的,菌種選育的基本內(nèi)容,根據(jù)菌種自然變異而進(jìn)行的自然選育，以及用人工方法引起菌種變異或形成新的雜種，再按照工業(yè)生產(chǎn)的要求進(jìn)行篩選來(lái)獲得新的變種或雜種。,菌種選育技術(shù),自然選育、誘變育種等方法屬于經(jīng)驗(yàn)育種的范疇 ；原生質(zhì)體技術(shù)、雜交育種、分子生物學(xué)方法等現(xiàn)代菌

31、種選育技術(shù)。,第一節(jié) 自然選育,自然選育是一種純種選育的方法。它利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過(guò)分離，篩選排除衰退型菌株，從中選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株。,一、自然選育的目的,1.純化菌種2.防止菌種衰退3.穩(wěn)定生產(chǎn)4.提高產(chǎn)量,一、菌種退化與變異原因,1．菌種遺傳特性的改變（1）遺傳基因型的分離 異核體現(xiàn)象（2）自發(fā)突變（回復(fù)突變）自發(fā)突變的原因：①用沙土管等長(zhǎng)期保藏；②菌種連續(xù)傳代

32、，這種自發(fā)突變比保藏過(guò)程中產(chǎn)生的比例要高；③活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的新陳代謝活動(dòng)，能產(chǎn)生一些具有誘變作用的物質(zhì)，當(dāng)這些物質(zhì)在胞內(nèi)累積到一定濃度時(shí)能誘發(fā)DNA結(jié)構(gòu)的改變。④DNA中存在的增變基因也能誘發(fā)基因突變。⑤有的微生物的染色體上還存在有導(dǎo)致菌體退化的死亡基因，DNA的代謝失調(diào)也會(huì)引起基因突變而造成菌種退化。⑥多因素低劑量的誘變效應(yīng)⑦互變異構(gòu)效應(yīng),2．經(jīng)誘變劑處理后的退化變異,①初篩出的菌落可能是由成對(duì)或成堆孢子發(fā)育成的，其中只有一個(gè)

33、細(xì)胞誘發(fā)了基因突變，在傳代中細(xì)胞核分裂時(shí)，未發(fā)生基因突變的細(xì)胞逐漸在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，便表現(xiàn)出產(chǎn)量下降。②可能是誘變菌種的細(xì)胞是異核體，而發(fā)生基因突變的只是其中一個(gè)細(xì)胞核的遺傳基因。那么在傳代過(guò)程中由于產(chǎn)生細(xì)胞核的分離現(xiàn)象，高產(chǎn)突變基因的核在數(shù)量上失去了優(yōu)勢(shì)，便出現(xiàn)產(chǎn)量性狀的退化變異。③突變發(fā)生在無(wú)意義鏈上，在遺傳信息傳遞過(guò)程中被丟失，致使正突變性狀的消失。④在誘變劑的作用下，被誘變菌種出現(xiàn)基因混雜，突變的高產(chǎn)基因雖然已經(jīng)傳遞到下一代

34、，但在傳代使用過(guò)程中，當(dāng)環(huán)境條件適合于低產(chǎn)型突變株繁殖時(shí)，使其在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，便表現(xiàn)出低產(chǎn)水平。,3.菌種生理狀況的改變,（1）一個(gè)菌種不是一個(gè)單一的群體，而是由一些變株混合而成的，這些變株所占的比例決定該菌種的特性。（2）菌種培養(yǎng)基的影響。（3）在某些培養(yǎng)條件下，菌體的某些基因處于活化狀態(tài)或阻遏狀態(tài)，而使得菌種的生理狀態(tài)改變。,二、自然選育的方法,1. 單孢子懸浮液的制備定量稀釋后制成50～200個(gè)單細(xì)胞／ml的菌懸液2. 分

35、離及單菌落培養(yǎng) 根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，按絲狀真菌、放線(xiàn)菌菌落大小不同，分離量以5～20個(gè)菌落／平皿為宜。 3．篩選 將分離培養(yǎng)后的各型單菌落，接斜面培養(yǎng)，成熟后接入發(fā)酵瓶，測(cè)定發(fā)酵單位的過(guò)程稱(chēng)為篩選。它分初篩、復(fù)篩兩個(gè)過(guò)程。初篩系指初步篩選，以多量篩選為原則。復(fù)篩是對(duì)初篩得到的高產(chǎn)菌株的復(fù)試，以挑選出穩(wěn)定高產(chǎn)菌株為原則。,初篩、復(fù)篩都要同時(shí)以生產(chǎn)菌株作對(duì)照。復(fù)篩選出的高單位菌株至少要比對(duì)照菌株產(chǎn)量提高5％以上，并經(jīng)過(guò)菌落純度、搖瓶單

36、位波動(dòng)情況，以及糖、氮代謝等的考察，合格后方可在生產(chǎn)罐上試驗(yàn)。復(fù)篩得到的高單位菌株應(yīng)制成沙土管、冷凍管或液氮管進(jìn)行保藏。,第二節(jié) 誘變育種,通過(guò)誘變劑處理就可以大大提高菌種的突變頻率，擴(kuò)大變異幅度，從中選出具有優(yōu)良特性的變異菌株，這種方法就稱(chēng)為誘變育種。誘變育種的特點(diǎn)：具有速度快、收效大、方 法簡(jiǎn)便 ；但是誘發(fā)突變?nèi)?

37、 乏定向性、工作量大。誘變育種工作主要包括出發(fā)菌株的選擇、誘變處理和篩選突變株三個(gè)部分。,一、誘變劑的種類(lèi),1.物理誘變劑紫外線(xiàn)、快中子、X射線(xiàn)、r-射線(xiàn)、激光2.化學(xué)誘變劑（1）堿基類(lèi)似物：5-Bu（2）與堿基起反應(yīng)的物質(zhì)：亞硝酸、氮芥、 羥胺、硫酸二乙酯、NTG（N-甲基-N-硝基- N-硝基胍）（3）丫啶類(lèi)3.生物誘變劑：噬菌體,二、突變誘發(fā)過(guò)程,前突變 ：誘變劑所造成的DNA分子的某一位

38、 置的結(jié)構(gòu)改變稱(chēng)之。前突變可以通過(guò)影響DNA復(fù)制而成為真正的突變，也可以經(jīng)過(guò)修復(fù)重新回到原有的結(jié)構(gòu)，即不發(fā)生突變。,（一)誘變劑接觸DNA分子前,1.細(xì)胞對(duì)誘變劑的透性將影響誘變效果。2.細(xì)胞質(zhì)的某些組分和某些酶可和誘變劑相 互作用而影響誘變效果。3.與基因所處的狀態(tài)有關(guān)，而基因的狀態(tài)又 和培養(yǎng)條件有關(guān)。,(二)DNA損傷的修復(fù),微生物有五種方式來(lái)修復(fù)DNA損傷。1．光復(fù)活作用2．切補(bǔ)修復(fù):

39、 四種酶的作用：核酸內(nèi)切酶 、核酸外 切酶 、DNA多聚酶 、DNA連接酶3. 重組修復(fù) ：又稱(chēng)為復(fù)制后修復(fù)4．SOS修復(fù)系統(tǒng) 5．DNA多聚酶的校正作用：增變突變型,(三)從前突變到突變,校正差錯(cuò) ：光復(fù)活作用、切補(bǔ)修復(fù)和DNA多聚 酶校正作用 引起差錯(cuò) ：重組修復(fù)和SOS修復(fù)系統(tǒng) 一切影響這些修

40、復(fù)系統(tǒng)中的酶活性的因素都能影響由前突變向突變轉(zhuǎn)變這一過(guò)程 。誘變前后的處理可影響誘變的效果 ：1.通過(guò)影響與DNA修復(fù)作用有關(guān)的酶的活性而影響誘 變的效果；2.通過(guò)使誘變的目的基因處于活化狀態(tài)(復(fù)制或轉(zhuǎn)錄狀 態(tài))，使之更容易被誘變劑所作用，從而影響目的基 因的突變率。,(四)從突變到突變型,表型遲延 ：突變基因的出現(xiàn)并不等于突變表型的出 現(xiàn)，表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)

41、 象。1．分離性遲延 是經(jīng)誘變處理后，細(xì)胞中的基因處于不純的狀態(tài)(野生型基因和突變型基因并存于同一細(xì)胞中)，突變型基因由于屬于隱性基因而暫時(shí)得不到表達(dá)，需經(jīng)過(guò)復(fù)制、分離，在細(xì)胞中處于純的狀態(tài)(一細(xì)胞中只有突變型基因，沒(méi)有野生型基因)時(shí)，其性狀才得以表達(dá)。2．生理性遲延 突變基因由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時(shí)，還不一定出現(xiàn)突變表型，新的表型必須等到原有基因的產(chǎn)物稀釋到某一程度后

42、才能表現(xiàn)出來(lái)。,三、誘變育種方案的設(shè)計(jì),誘變育種包括三個(gè)環(huán)節(jié)：突變的誘發(fā)、突變株的篩選和突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)。 (一)制定篩選目標(biāo) (二)制定篩選方案 1．誘變過(guò)程 (1) 出發(fā)菌種的斜面 (2) 單孢子懸浮液制備 (3) 孢子計(jì)數(shù) (4) 單菌落分離,2．篩選過(guò)程,(1) 傳種斜面 (2) 留種保藏菌種 (3) 篩選高產(chǎn)菌株,四、突變的誘發(fā),突變的誘發(fā)受到菌種的遺傳特性、誘變劑、菌種的生理狀態(tài)以

43、及誘變處理時(shí)環(huán)境條件的影響。1.出發(fā)出株的選擇（1）選擇純種 選擇發(fā)酵產(chǎn)量穩(wěn)定、波動(dòng)范圍小的菌株 （2）選擇具有優(yōu)良性狀的出發(fā)菌株 選擇的出發(fā)菌株應(yīng)當(dāng)具有我們所需要的代謝特性 （3）對(duì)誘變劑敏感 可以提高變異頻率，而且高產(chǎn)突變株的出現(xiàn)率也大（4）選擇多個(gè)出發(fā)菌株,2.誘變劑的選擇,（1）根據(jù)出發(fā)菌株的遺傳背景（2）菌株遺傳性質(zhì)的穩(wěn)定程度（3）誘變劑本身的特點(diǎn)（4）誘變劑的劑量,3.影響誘變效果的因素,（1）菌種的遺

44、傳穩(wěn)定性以及對(duì)誘變劑的敏感性（2）菌種的生理狀態(tài)（3）菌種的預(yù)處理和后處理?xiàng)l件（4）其他外界條件,五、突變株的篩選,(一)隨機(jī)篩選 1．搖瓶篩選法 2．瓊脂塊篩選法3．篩選自動(dòng)化和篩選工具微型化 (二) 理性化篩選 指運(yùn)用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機(jī)制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株的篩選方法。,1

45、．初級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選,(1)降低終產(chǎn)物濃度：①篩選終產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)缺陷型 ②篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株 (2)篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變菌株 ①篩選結(jié)構(gòu)類(lèi)似物(抗代謝物)抗性突變株 抗反饋抑制 、抗反饋?zhàn)瓒?②利用回復(fù)突變篩選抗反饋突變菌株,2．次級(jí)代謝產(chǎn)物(主要是抗生素)高產(chǎn) 菌株的篩選,(1) 利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選 滲漏缺陷型是遺傳性障礙不完全的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，突變使某一種酶的活性下降而不是完全喪失，所以這種缺陷型

46、能夠少量地合成某一代謝產(chǎn)物，能在基本培養(yǎng)基上少量地生長(zhǎng)。(2)篩選負(fù)變株或零變株的回復(fù)突變株 (3) 篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株 (4) 篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株(5) 篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株,(6)篩選二價(jià)金屬離子抗性突變株 (7)篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株(8) 篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株3.營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選 （1）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的富集 抗生素富集法、過(guò)濾法。（2）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出 點(diǎn)種法、

47、夾層瓊脂法（3）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定 點(diǎn)種法、生長(zhǎng)譜法六、突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn),七、誘變育種工作前的準(zhǔn)備工作,1.菌種培養(yǎng)特性的摸索。2.最佳培養(yǎng)條件的摸索。3.產(chǎn)單位高峰時(shí)間。4.菌種保藏條件的建立。5.菌種的遺傳背景。,第三節(jié) 雜交育種,雜交育種 是指將兩個(gè)基因型不同的菌株經(jīng)吻合(或接合)使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。雜交育種的目的在于：（1）通過(guò)雜交使不同菌株的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換和重新組合

48、，從而改變?cè)芯甑倪z傳物質(zhì)基礎(chǔ)，獲得雜種菌株(重組體)；（2）可以通過(guò)雜交把不同菌株的優(yōu)良生產(chǎn)性能集中于重組體中，克服長(zhǎng)期用誘變劑處理造成的菌株生活力下降等缺陷；（3）通過(guò)雜交，可以擴(kuò)大變異范圍，改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，甚至出現(xiàn)新的品種；（4）分析雜交結(jié)果，可以總結(jié)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律，促進(jìn)遺傳學(xué)理論的發(fā)展。,霉菌的雜交育種,準(zhǔn)性生殖(Parasexual reproduction)是指真菌中不通過(guò)有性生殖的基因重組過(guò)程。

49、 ① 選擇直接親本 ② 異核體的形成 ③ 雜合雙倍體的形成 ④ 體細(xì)胞重組 染色體交換 、染色體單倍化,第四節(jié) 原生質(zhì)體技術(shù),一、原生質(zhì)體制備1．菌體的預(yù)處理 2．菌體的培養(yǎng)時(shí)間 3．酶濃度 4．酶解溫度 5．酶解時(shí)間 6．滲透壓穩(wěn)定劑,,二、原生質(zhì)體的融合 三、融合子的選擇四、原生質(zhì)體的再生五、原生質(zhì)體的誘變六、原生質(zhì)體再生與常規(guī)誘變相結(jié)合 七、滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)在育種中的應(yīng)用1.單一親株滅活

50、2．雙親株或多親株滅活,第四章 培養(yǎng)基,第一節(jié) 概述一、培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基：是人們提供給微生物生長(zhǎng)繁殖和生物合成 各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的 多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基造成的影響：菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成、產(chǎn)品的 分離精制、產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量,二、配制工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的一般要求,1.滿(mǎn)足菌

51、體生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成。2.理化性質(zhì)穩(wěn)定。3.黏度適中。4.原材料主要要有利于產(chǎn)物合成。5.不影響通氣攪拌和產(chǎn)物的分離精制6.因地制宜，質(zhì)優(yōu)價(jià)廉。,第二節(jié) 培養(yǎng)基的成分,一、碳源功能：碳架、能源1.糖類(lèi)：?jiǎn)翁恰㈦p糖、多糖2.脂肪3.有機(jī)酸、醇4.碳?xì)浠衔锒?、氮源功能：氮?1.無(wú)機(jī)氮源：特點(diǎn)：成分單一、質(zhì)量穩(wěn)定； 容易被吸收利用 改變培養(yǎng)液的PH氨水、銨鹽2.有機(jī)氮

52、源特點(diǎn)：成分復(fù)雜 被菌體利用的速度不一 微生物對(duì)氨基酸的利用有選擇性 易引起發(fā)酵水平的波動(dòng)農(nóng)副產(chǎn)品,三、無(wú)機(jī)鹽和微量元素四、水五、前體六、消沫劑七、其它,第三節(jié) 培養(yǎng)基的種類(lèi)和選擇,一、培養(yǎng)基的種類(lèi)1.孢子培養(yǎng)基要求：能使菌體快速生長(zhǎng)，產(chǎn)孢子的數(shù)量多、質(zhì)量好，不引起菌種變異。麩皮培養(yǎng)基、大（?。┟着囵B(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基2.種子培養(yǎng)基要求：營(yíng)養(yǎng)適當(dāng)?shù)刎S

53、富和完全，氮源和維生素的含量適當(dāng)略 高，但總濃度以略稀薄為宜，和發(fā)酵培養(yǎng)基相適應(yīng)。3.發(fā)酵培養(yǎng)基要求：組成要適當(dāng)豐富和完全，滿(mǎn)足菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成,二、培養(yǎng)基的設(shè)計(jì),1.碳氮比2.生理酸性和堿性物質(zhì)比三、培養(yǎng)基的篩選單因子試驗(yàn)、正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)等,第四節(jié) 影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素,一、原材料質(zhì)量的影響品種、產(chǎn)地、加工方法、批號(hào)等二、水質(zhì)的影響三、滅菌的影響四、其它,第五章 滅菌與除菌,染菌的危害：1.

54、消耗培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分。 2.分泌某些對(duì)產(chǎn)生菌有毒或 能使抗生素失活得物質(zhì)。 3.影響后處理工藝。 4.影響產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。 5.可能會(huì)引起大幅度染菌，

55、 連續(xù)染菌。,第一節(jié) 滅菌的基本原理,一、幾種常用的滅菌方法的基本原理1.化學(xué)物質(zhì)滅菌 甲醛、苯酚、高錳酸鉀、新潔爾滅、來(lái)蘇兒等。2.輻射滅菌：紫外線(xiàn)、X射線(xiàn)、r射線(xiàn)3.干熱滅菌4.濕熱滅菌5.臭氧滅菌6.過(guò)濾滅菌,二、濕熱滅菌的原理,幾個(gè)概念：,1.致死溫度2.致死時(shí)間3.熱阻4.相對(duì)熱阻對(duì)數(shù)殘留定律：dN/dT = - KN

56、 T=(2.303 log N0/NS)/K,第二節(jié) 培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌,一、培養(yǎng)基滅菌溫度的選擇殺死微生物的活化能大于營(yíng)養(yǎng)成分破壞的活化能-------------------高溫快速滅菌法二、培養(yǎng)基的滅菌方法1. 分批滅菌（實(shí)罐滅菌，實(shí)消）2. 連續(xù)滅菌 （連消）,,連續(xù)滅菌的特點(diǎn)：1.可采用高溫快速滅菌工藝，營(yíng)養(yǎng)成分破壞較少。2.發(fā)酵罐非生產(chǎn)占用時(shí)間縮短，容積利用率提高。3.熱能利用合理，

57、適合實(shí)行自動(dòng)化控制。4.不適合黏度大或固形物含量高的培養(yǎng)基的滅菌。5.增加一套連續(xù)滅菌設(shè)備，增加了操作環(huán)節(jié)，增加 了染菌的機(jī)會(huì)。,三、發(fā)酵設(shè)備的滅菌,滅菌要點(diǎn)：1.設(shè)備的嚴(yán)密度。2.溫度和壓力是否相互對(duì)應(yīng)。3.防止滅菌死角。,第三節(jié) 空氣除菌,主要的滅菌方法：1.加熱滅菌2.靜電除菌3.介質(zhì)過(guò)濾除菌,第四節(jié) 無(wú)菌檢查與染菌的處理,一、無(wú)菌檢查分析：無(wú)菌試驗(yàn)、培養(yǎng)液的顯微鏡檢查、培養(yǎng)液的生化指標(biāo)變化無(wú)菌試驗(yàn)