鄰苯二甲酸酯降解菌CQ0110Y降解相關(guān)基因和蛋白研究.pdf

1、我室前期從長(zhǎng)江和嘉陵江水中檢出178種有機(jī)污染物，其中鄰苯二甲酸酯(PhthalicAcidEsters，PAEs)是主要污染物，濃度達(dá)到22.8μg/L；同時(shí)，PAEs也是重慶市主城區(qū)人群體內(nèi)的主要污染物，濃度達(dá)到78.29μg/L。我們針對(duì)PAEs的生物降解開展了相關(guān)研究。從污染環(huán)境中分離了多株P(guān)AEs降解菌，均能以PAEs為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)，其中降解菌CQ0110Y的降解效率最高。本實(shí)驗(yàn)圍繞降解菌CQ0110Y的基本性狀、降

2、解相關(guān)基因和降解相關(guān)蛋白三部分內(nèi)容展開研究，為CQ0110Y的環(huán)境污染治理應(yīng)用打下了一定基礎(chǔ)。 一、鄰苯二甲酸酯降解菌CQ0110Y基本性狀 1.根據(jù)伯杰氏細(xì)菌分類手冊(cè)第八版和第九版中描述的模式菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化特征，結(jié)合16SrRNA在genbank中的比對(duì)結(jié)果，菌株CQ0110Y屬于微桿菌屬(Microbacteriumsp.)。這是國(guó)際上首次報(bào)道的具有PAEs降解性能的微桿菌屬細(xì)菌。 2.CQ0110Y

3、進(jìn)行生物降解反應(yīng)的最佳pH為6.0～8.0；最佳溫度為20～35℃。 3.當(dāng)DEHP初始濃度低于1350mg/L時(shí)，CQ0110Y對(duì)不同初始濃度DEHP的降解反應(yīng)符合同一指數(shù)動(dòng)力學(xué)模型，動(dòng)力學(xué)方程：InC=-0.4087t+A；半減期t1/2=1.59d。 4.CQ0110Y對(duì)DEHP的降解性能優(yōu)于其它幾種PAEs，對(duì)其它PAEs的降解性能隨著PAEs側(cè)鏈碳原子的增加而下降。 5.推測(cè)DEHP在CQ0110Y菌作

4、用下可能的生物降解途徑為：鄰苯二甲酸酯在酯酶作用水解成單酯，繼續(xù)水解成鄰苯二甲酸，進(jìn)一步降解成苯甲酸，苯甲酸在加氧酶作用下形成鄰羥基苯甲酸，鄰羥基苯甲酸脫羧基生成苯酚，進(jìn)一步生成鄰苯二酚，在1，2-雙加氧酶作用下生成己二烯二酸，進(jìn)一步生成丙酮酸、琥珀酸等進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水。 二、鄰苯二甲酸酯降解菌CQ0110Y降解相關(guān)基因研究 1.通過限制性內(nèi)切酶SAu3AI隨機(jī)酶切細(xì)菌基因組DNA，回收3-10kb

5、范圍的DNA片段，采用stratagene公司的基因組文庫構(gòu)建試劑盒(載體為ZAPExpressVector和pBK-CMVVector，宿主菌是xLl-B1ueMRF’strain和XLOLRstrain，噬菌體包裝試劑為GigapackⅢGoldpackagingextract)，構(gòu)建了降解菌CQ0110Y的基因組文庫。經(jīng)效價(jià)測(cè)定，該文庫效價(jià)達(dá)到5x107PFU/μg連接DNA，文庫質(zhì)量高。 2.采用鄰苯二甲酸酯瓊脂平板特異

6、性選擇篩選法獲得150個(gè)陽性克隆，陽性克隆獲得率為1.2x10-4。經(jīng)過輔助噬菌體作用的單克隆切除，卡那霉素平板及PAEs無機(jī)鹽培養(yǎng)基雙重篩選，最終獲得一株陽性克隆菌株。 3.根據(jù)載體已知序列設(shè)計(jì)PCR引物，以重組體質(zhì)粒為模板，對(duì)目的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序，將DNA序列在GenBank中進(jìn)行登記，取得登記號(hào)為EF449771；采用ORFFinder對(duì)目的DNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，目的DNA中含有2895bp的ORF

7、，命名為phtY；經(jīng)過在Genbank數(shù)據(jù)庫的blast檢索比對(duì)，phtY與phosphoenolpyruvateCarboxylase(磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶)的編碼基因高度同源，同源性達(dá)到99％。 4.根據(jù)目的DNA已知序列設(shè)計(jì)PCR引物，以CQ0110Y基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1700bp的DNA片段，與引物設(shè)計(jì)的DNA大小一致，驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)獲得的phtY基因來源菌株CQ0110Y；同時(shí)，提取CQ0110Y總RNA，

8、經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-PCR，也得到1700bp的DNA片段，說明phtY基因不但來源于菌株CQ0110Y并且能夠在細(xì)菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA，可以編碼相應(yīng)的功能蛋白。 5.根據(jù)報(bào)道的PAEs降解菌DBF63的已知降解相關(guān)基因phtC設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，以本實(shí)驗(yàn)的PAEs降解菌CQ0110Y的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增相應(yīng)的功能基因。獲得700bp的DNA片段，經(jīng)與T載體連接后測(cè)序，序列分析顯示含有450bp的ORF，blast

9、檢索比對(duì)顯示為一功能未知的基因，但與phtC基因無同源性，原因不清楚。 三、鄰苯二甲酸酯降解菌CQ0110Y降解相關(guān)蛋白研究 1.制備CQ0110Y菌分別在LB培養(yǎng)基和PAEs無機(jī)鹽培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的菌體總蛋白，分別代表CQ0110Y在PAEs誘導(dǎo)前后的總蛋白。采用二維凝膠電泳分離總蛋白，通過軟件分析，誘導(dǎo)前總蛋點(diǎn)有846個(gè)，誘導(dǎo)后總蛋白點(diǎn)有847個(gè)，誘導(dǎo)后新增加7個(gè)蛋白點(diǎn)，消失6個(gè)蛋白點(diǎn)，3倍以上表達(dá)上調(diào)有11個(gè)蛋白點(diǎn)，3

10、倍以上表達(dá)下調(diào)有9個(gè)蛋白點(diǎn)，2倍到3倍表達(dá)上調(diào)有33個(gè)蛋白點(diǎn)，2倍到3倍表達(dá)下調(diào)有38個(gè)蛋白點(diǎn)，總共有2倍以上表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)104個(gè)。 2.分別對(duì)誘導(dǎo)后2倍以上表達(dá)差異的104個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析，經(jīng)過MSCOT搜索引擎檢索對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定。根據(jù)這些功能蛋白的表達(dá)情況分析，PAEs降解菌CQ0110Y菌處在PAEs無機(jī)鹽培養(yǎng)基這個(gè)比較特殊的環(huán)境中，主要發(fā)生了四方面的改變。 (1)為應(yīng)對(duì)PAEs類物質(zhì)的細(xì)胞毒

11、性，細(xì)菌增強(qiáng)了對(duì)外環(huán)境的抗應(yīng)激及修復(fù)能力，增加了觸發(fā)因子和應(yīng)急蛋白ClpB等分子伴侶、核糖體蛋白、轉(zhuǎn)肽酶以及核甙酸基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量。 (2)為應(yīng)對(duì)所處的貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，增強(qiáng)從外界攝取物質(zhì)及能量的能力，增加了甲酰四氫葉酸酯合成酶、帶7蛋白、多糖轉(zhuǎn)運(yùn)外膜蛋白及外膜孔道蛋白OmpF的表達(dá)量。 (3)增強(qiáng)了利用培養(yǎng)基內(nèi)作為唯一碳源和能源的PAEs的能力，水解酶、加氧酶、脫羧酶等降解功能相關(guān)的蛋白酶的表達(dá)量由此得到增加。 (4

12、)與LB培養(yǎng)基相比，細(xì)菌在PAEs無機(jī)鹽培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)變緩，許多與生長(zhǎng)代謝相關(guān)的蛋白酶的表達(dá)下調(diào)，包括DNA解螺旋酶、RNA聚合酶、DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白、組氨酸激酶、天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶等。 3.本研究結(jié)果提示很有必要對(duì)這些功能蛋白酶(如MEHP水解酶、加氧酶、雙加氧酶、脫羧酶等)繼續(xù)進(jìn)行深入研究。 總之，本研究基于從污染環(huán)境分離的PAEs降解菌CQ0110Y進(jìn)行了系列研究，該菌能夠利用PA

13、Es作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)，具有高效降解性能，初步闡明了生物降解機(jī)理。通過構(gòu)建并篩選基因組文庫獲得了PAEs降解相關(guān)基因phtY；通過蛋白質(zhì)譜差異表達(dá)蛋白觀察到了PAEs降解相關(guān)蛋白(MEHP水解酶、加氧酶、雙加氧酶、脫羧酶等)并分析了降解菌CQ0110Y在PAEs無機(jī)鹽培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)生的系列變化。該研究與國(guó)內(nèi)外其它相關(guān)報(bào)道比較，發(fā)現(xiàn)降解菌為應(yīng)對(duì)貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境而發(fā)生了系列變化，這是以前未見報(bào)道的。今后應(yīng)進(jìn)一步開展MEHP水解酶、加氧酶、雙加