相襯顯微鏡

1、相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）又稱相襯顯微鏡。在光學(xué)顯微鏡的改進(jìn)過(guò)程中，相襯顯微鏡的制造成功和普遍的應(yīng)用，是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就。在1935年荷蘭學(xué)者澤尼克（P.Zernike）提出了相襯法原理，至1941年由德國(guó)蔡司工廠誕生了世界上第一臺(tái)相襯顯微鏡。它的產(chǎn)生，使人類的視覺(jué)在光學(xué)顯微鏡下又得到新的擴(kuò)展。從信息利用的角度來(lái)看，人們將它視為光學(xué)信息處理概念下的第一個(gè)產(chǎn)品，因而獲得了1953年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)

2、。我們知道，人眼只能在光波的波長(zhǎng)（顏色）和振幅（亮度）有變化的情況下，才能在顯微鏡下看到被檢物體的存在，但活的生物體多是無(wú)色透明的，當(dāng)光線通過(guò)時(shí)，波長(zhǎng)和振幅變化不顯著，這樣在明場(chǎng)鏡檢下就難于觀察清晰。為了克服這一困難，可以采用一定的措施，如物理、化學(xué)處理法、材料經(jīng)固定、染色等過(guò)程，使被檢物體的顏色及亮度發(fā)生變化，但這只能觀察已被殺死的材料，而不能觀察到活體狀態(tài)；當(dāng)然，縮小聚光鏡的孔徑光闌，以增加明暗反差的對(duì)比，但這樣不能充分發(fā)揮物鏡數(shù)值

3、孔徑的性能，細(xì)微結(jié)構(gòu)仍難于被分辨，同時(shí)鏡象亮度也隨之降低；利用暗場(chǎng)、熒光或偏光鏡檢術(shù)，雖然能觀察活體標(biāo)本，但這些顯微術(shù)都是利用不同的光學(xué)原理，達(dá)到特定的觀察目的，鏡檢效果局限在一定范圍內(nèi)?？梢?jiàn)上述措施都不能得到滿意的鏡檢效果，而采用相襯顯微術(shù)，則能解決上述問(wèn)題，使無(wú)色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)在相襯顯微鏡下變得清晰可見(jiàn)。這種顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。一、一、相差顯微鏡相差顯微鏡的特點(diǎn)的特

4、點(diǎn)相差顯微鏡是一種將光線通過(guò)透明標(biāo)本細(xì)節(jié)時(shí)所產(chǎn)生的光程差（即相位差）轉(zhuǎn)化為光強(qiáng)差的特種顯微鏡。光線通過(guò)比較透明的標(biāo)本時(shí)，光的波長(zhǎng)（顏色）和振幅（亮度）都沒(méi)有明顯的變化。因此，用普通光學(xué)顯微鏡觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本（如活的細(xì)胞）時(shí)，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)往往難以分辨。然而，由于細(xì)胞各部分的折射率和厚度的不同，光線通過(guò)這種標(biāo)本時(shí)，直射光和衍射光的光程就會(huì)有差別。隨著光程的增加或減少，加快或落后的光波的相位會(huì)發(fā)生改變（產(chǎn)生相位差）。光的相位差人的肉眼感

5、覺(jué)不到，但相差顯微鏡能通過(guò)其特殊裝置環(huán)狀光闌和相板，利用光的干涉現(xiàn)象，將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢圆煊X(jué)的振幅差（明暗差），從而使原來(lái)透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對(duì)比度增強(qiáng)，使我們能比較清楚的觀察到普通光學(xué)顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些細(xì)微結(jié)構(gòu)。二、二、相差顯微鏡相差顯微鏡的成像原理的成像原理鏡檢時(shí)光源只能通過(guò)環(huán)狀光闌的透明環(huán)，經(jīng)聚光器后聚成光束，這束光線通過(guò)被檢物體時(shí)，因各部分的光程不同，光線發(fā)生不同程度

6、的偏斜（衍射）。由于透明圓環(huán)所成的像恰好落在物鏡后焦點(diǎn)平面和相板上的共軛面重合。因此，未發(fā)生偏斜的直射光便通過(guò)共軛面，而發(fā)生偏斜的衍射光則經(jīng)補(bǔ)償面通過(guò)。由于相板上的共軛面和補(bǔ)償面的性質(zhì)不同，它們分別將通過(guò)這兩部分的光線產(chǎn)生一定的相位差和強(qiáng)度的減弱，兩組光線再經(jīng)后透鏡的會(huì)聚，又復(fù)在同一光路上行進(jìn)，而使直射光和衍射光產(chǎn)生光的干涉，變相位差為振幅差。這樣在相差顯微鏡鏡檢時(shí)，通過(guò)無(wú)色透明體的光線使人眼不可分辨的相位差轉(zhuǎn)化為人眼可以分辨的振幅差（

7、明暗差）。三、三、相差顯微鏡相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)和裝置的結(jié)構(gòu)和裝置相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)是相同的，所不同的是它具有四部分特殊結(jié)構(gòu)：即環(huán)狀光闌、相板、合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡及綠色濾光片。3.3.合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡是相差顯微鏡一個(gè)極為重要的結(jié)構(gòu)。環(huán)狀光闌的像必須與相板共軛面完全吻合，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)直射光和衍射光的特殊處理。否則應(yīng)被吸收的直射光被泄掉，而不該吸收的衍射光反被吸收，應(yīng)推遲的相位有的不能被推遲，這樣就不能達(dá)到相差鏡檢的效果

8、。由于環(huán)狀光闌是通過(guò)轉(zhuǎn)盤(pán)聚光器與物鏡相匹配的，因而環(huán)狀光闌與相板常不同軸。為此，相差顯微鏡配備有一個(gè)合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡（在鏡的外殼上標(biāo)有“CT”符號(hào)），用于合軸調(diào)節(jié)。使用時(shí)撥去一側(cè)目鏡，插入合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，旋轉(zhuǎn)合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡的焦點(diǎn)，便能清楚看到一明一暗兩個(gè)圓環(huán)。再轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器上的環(huán)狀光闌的兩個(gè)調(diào)節(jié)鈕，使明亮的環(huán)狀光闌圓環(huán)與暗的相板上共軛面暗環(huán)完全重疊。如明亮的光環(huán)過(guò)小或過(guò)大，可調(diào)節(jié)聚光器的升降旋鈕，使兩環(huán)完全吻合。如果聚光器已升到最高點(diǎn)或降到

9、最低點(diǎn)而仍不能矯正，說(shuō)明玻片太厚了，應(yīng)更換。調(diào)好后取下望遠(yuǎn)鏡，換上目鏡即可進(jìn)行鏡檢觀察。4.4.綠色濾光片綠色濾光片由于使用的照明光線的波長(zhǎng)不同，常引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長(zhǎng)范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來(lái)調(diào)整光源的波長(zhǎng)。Olympus廠家生產(chǎn)的相差顯微鏡在鏡檢時(shí)要使用該廠規(guī)定的IF550綠色濾光片作為配套器件。四、四、相差顯微鏡相差顯微鏡的使用范圍、操作步驟及注意事項(xiàng)的使用范圍、操作步驟及注

10、意事項(xiàng)1.使用范圍相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細(xì)節(jié)，適用于對(duì)活體細(xì)胞生活狀態(tài)下的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、增殖情況及細(xì)微結(jié)構(gòu)的觀察。因此，是微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、細(xì)胞工程、雜交瘤技術(shù)等現(xiàn)代生物學(xué)研究的必備工具。2.操作步驟（1）根據(jù)觀察標(biāo)本的性質(zhì)及要求，挑選適合的相差物鏡。（2）將標(biāo)本片放到載物臺(tái)上。（3）進(jìn)行光軸中心的調(diào)整。（4）取下一側(cè)目鏡，換上合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，調(diào)整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)完全重疊吻合，然后取下合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，