應(yīng)用酶免疫方法檢測(cè)生物制品中殘余牛血清白蛋白含量

1、中國生物 制品學(xué) 雜志 2 O O 4年 5 月第 1 7 卷第 3 期 C h i nJB i o l 曬c a l sM a y2 0 0 4 ， V o 1 ． 1 7N o ． 3·l 7 l·應(yīng)用酶免疫方 法檢測(cè) 生物 制品中殘余牛血清 白蛋 白含量 周鐵群 陳 震 強(qiáng)東【 摘 要】目的 應(yīng)用酶免疫方法檢測(cè)生物制品中殘余牛血清 白蛋 白( B S A ) 含量。方法 制備高親和力 、 高 純度 的抗 B S

2、 A單克隆抗 體作 為包 被抗體 ， 高 純度 、 高 效價(jià) 的兔抗 B S A多 克 隆抗體 為 酶標(biāo)抗 體 ， 采用 E L I S A夾 心方 法 ， 以系列含量 的 B S A溶 液作 為標(biāo) 準(zhǔn) ， 制 備標(biāo) 準(zhǔn) 曲線 ， 對(duì)樣 品 中所 含 B S A進(jìn)行 定量 。結(jié)果 優(yōu) 化 了酶 免 疫反 應(yīng)條 件 ， 標(biāo) 準(zhǔn) 曲線線性 范 圍內(nèi) r ≥O ． 9 8 ， 經(jīng)驗(yàn)證 ， 該方 法對(duì) B S A的最 低檢 測(cè)限為 2 ． 5n

3、 e C n a 。分別 檢測(cè) 5 、 1 O 、 3 0nI l 1 l 含量 的 B S A時(shí) ， 試驗(yàn) 內(nèi)( n =l 1 ) 和試驗(yàn) 間( n = 3 ) 測(cè)定的變異 系數(shù)分別 為 2 ． 3 ％ ～ 4 ． 9 ％和 4 ． O ％ 一 6 ． 1 ％ ； 回收率均 值分別 為 1 0 4 ％ 、 1 2 3 ％和 1 0 9 ％。未見該方法 與人 、 馬、 豬血清 白蛋 白之 間的交叉 反 應(yīng) 。結(jié)論 該 法敏 感度 高 ，

4、 準(zhǔn)確性 、 重 復(fù)性和穩(wěn)定性好 ， 可用 于生物制 品的質(zhì)量控 制?！?關(guān)鍵詞】 E L I S A夾心法； 生物制品； 牛血清白蛋白； 定量 目前 ， 我國生物制品 中殘余牛血清蛋 白檢測(cè) 主 要采用反向間接血凝法 和放射免疫法。此兩種方法 均存在一定的不穩(wěn)定性 ， 且操 作繁瑣。國外普遍采 用酶免疫方法 ， 為與國際接軌 ， 本文采用 E L I S A夾心 法 ( S a n d w i c hE us A ) ， 對(duì)生物制品中

5、殘余 B S A進(jìn)行定 量， 并對(duì)這一方法 的特異性 、 穩(wěn)定性和敏感性進(jìn)行 了初步驗(yàn)證。材料與方法 1 ． 材料和儀器 免疫用 B S A購 自 S i g m a 公司 ， 純度大于 9 8 ． 0 ％；標(biāo)準(zhǔn) B S A購 自美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所 ( N I s T ) ；人 、 馬、 豬血清 白蛋 白購 自 S i g m a 公 司； 人血 白蛋 白溶液濃度為 2 0 0g ／ L ， 綠十字 ( 中國) 生物制品有限公 司

6、生產(chǎn) ， 批號(hào) 2 0 0 3 0 3 1 0 ， 由本所血液制品室提供。單抗 亞 型 檢 測(cè) 用 美 國 Z Y M E D公 司 的 M o u s eM o n o A BI DI ( r I ' ( m ) ； 辣根 過氧化物酶 ( H r u P ) 購 自德國 B o e h r i n g e rM a n n h e i m公 司 ； T M B為美 國 K P L公 司生產(chǎn) ； 酶標(biāo)儀為 We U s c a

7、nM K 3 ( L a b s y s t e m sD r a g o n ) 。2 ． 抗 l I S A單抗的制備及篩選 按常規(guī)方法 制備 抗 B S A單 抗 ， 采用 B S A免疫 B A L B ／ c小 鼠， 共 3次 ， 每 次 間 隔 2—3周 。取 脾 ，S P 2 ／ 0 骨髓瘤細(xì)胞融合 ， E L I S A方法篩選陽性克隆 ， 檢 測(cè)單抗亞型 。大量制備并純化單抗 。3 ． 抗 B S A多克隆抗體的制備及

8、標(biāo)記 B S A抗原免疫新西蘭 白兔 3 次 ， 每次間隔 1 周 ，作者單位 ： l 中國藥 品生物制 品檢定 所 ( 北京 1 0 0 0 5 0 ) ； 2 無 錫博 生醫(yī)用生物技術(shù)開 發(fā)有限公司 ( 無錫 2 1 4 0 2 8 ) ．作者簡(jiǎn)介 ： 周鐵群 ( 1 9 6 5 一) ， 女 ， 副研 究員 ， 主要從事 生物制品科 研及檢定 工作 ．采血 ， 硫酸銨沉淀及層析純化 ， 蛋 白定量 ， 常規(guī)過碘 酸鈉一 乙二醇方法

9、標(biāo)記辣根過氧化物酶 ( H R P ) ， 測(cè)定 抗體效價(jià) 。4 ． E 】夾 心法 將定量后 的單抗 以 1 ： 2 0 0—1 ： 4 0 0系列稀釋后 包被 9 6 孔酶標(biāo)板 ， 4 o ( = 包被過夜 ， 3 7 ~ C 封閉 1h 。分 別加入 04 0n g ， l T l l 濃度 B S A的標(biāo)準(zhǔn)溶液 ， 每濃度 2孔 ， 1 0 0l ／ 孔 。以稀釋液作為空 白對(duì) 照。待測(cè)樣 品 分別測(cè)定原倍 和 2 倍 稀釋后濃

10、 度。3 7 ％孵育 1h ，P B S T - T w e e n2 0洗滌。加入 1 ： 80 0 0—1 ： 1 20 0 0 稀釋 的酶標(biāo) 抗 B S A多克 隆抗體 ， 1 0 0孔 ， 室溫 3 0m i n 。P B S T - T w e e n2 0 洗滌 。加 入 T M B顯色 ， 1 0 0孔 ， 室 溫 1 0m i n 。加入1m o l ／ L H C 1 終止 。測(cè)定 ， 以0n g ／l T l l

11、標(biāo)準(zhǔn)溶液的 A值消零。以 B S A含量為橫坐標(biāo) ， A值( 兩孔均值 ) 為縱坐標(biāo) ， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)為一直 線相關(guān)。5 ． 試劑盒測(cè)定參數(shù)的確定 經(jīng) 3 0 次以上試驗(yàn) ， 進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理 ， 確定試 驗(yàn) 相關(guān)參數(shù)需滿 足 以下條件 ， 試驗(yàn)方有效 ： 0r i g ／ h a標(biāo) 準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照的 A值之差不得超過 0 ． 1 0 ， 否則 認(rèn)為洗滌不充分 ； 0n g ／ n a標(biāo)準(zhǔn) 溶液 A值 ≤0 ． 1 5 ； 4 0

12、w C m l 標(biāo) 準(zhǔn)溶液 A值 ≥1 ． 0 ； 內(nèi)部參 比品測(cè)定濃度范 圍： 2 8 —3 6n g ／ n a ； 標(biāo)準(zhǔn)曲線 r ≥0 ． 9 8 。6 ． E IS A夾心方法的驗(yàn)證u - 36 ． 1 準(zhǔn)確性( 重復(fù)性 ) ： 配制試驗(yàn)直線測(cè)定范圍 內(nèi)高( 3 0n g ／ n a ) 、 中( 1 0n g ／ n a ) 、 低 ( 5n g ／ n a ) 3 個(gè)不 同 濃度的 B S A溶液 ， 每一 濃度配制 2份樣

13、 品 ， 每一次 試驗(yàn)對(duì) 6 份樣 品重復(fù)測(cè)定 3 次， 比較測(cè)定值 和真實(shí) 值 ， 求出回收率即偏差。比較實(shí)際測(cè)定 值和理論值 之間的差異 ( 回收率) 。維普資訊 http://www.cqvip.com 中國生物 制品學(xué)雜志 2 O O 4 年 5 月第 l 7 卷第 3 期 C h i nJB i o l o g i c a l sM a y2 O O 4 ， V o 1 ． 1 7N o ． 3·l 7 3 

14、3;液的 A值及 r 值均無 明顯 變化 ( 降低 ) ， 系統(tǒng)穩(wěn) 定 ，表明試劑盒 的穩(wěn)定性較好 ， 見表 2 。表 23 r 7 ℃放 置 3d 和 7d 熱穩(wěn)定性 結(jié)果 6 ． 特異 性 We s t e r nb l o t 結(jié) 果顯 示包 被抗 體僅 與濃 度 為 1． - J n ~的 B S A反應(yīng) ， 與相 同濃度的 H S A 、 H o s A和 P S A無交叉反應(yīng) 。E L I S A試 驗(yàn)顯示本試劑盒與 1 0

15、m l～ 1 0 0m g ／ n ~濃度 的 H S A無 交叉反應(yīng) ， 且 添加 H S A不影響制品中 B S A含量的測(cè)定 。見表 3 。表 3 試 劑盒與人血 白蛋 白交叉反應(yīng)的結(jié)果 眥 濃度 A () A () A ()^ (T n 1 )A(T n 1 )^(T n 1 )7 ． 初步應(yīng)用及與不 同方法的比較 采用本試劑盒 ( S - E L I S A ) 檢測(cè) 國產(chǎn)疫苗及 進(jìn) 口疫苗 中 的殘 余 B S A含量 ，

16、 并 與反 向間接 血凝 方法 ( H A ) 和放射免疫方 法( R) 檢測(cè) 的結(jié)果進(jìn)行 比較。結(jié)果表明： ①血凝方法的穩(wěn)定性尚不理想 ， 同一批試 劑盒靈敏度有 時(shí)3 ． 1 2 5nm l ， 有 時(shí) l 2 ． 5nm l ， 測(cè) 定 結(jié)果( 不 同實(shí)驗(yàn)室之間或不 同測(cè)定之間) 差異較 大。②血凝方法只能定 量至整倍 ( 2 倍 間隔) 的濃度 ， 如 6 ． 2 5 、 1 2 ． 5 、 2 5 、 5 0nm l 等 ，

17、造成“ 誤差” 較大 ， 尤其 是 當(dāng)制品中殘余牛血清 白蛋 白含量高時(shí) ， 定量 間隔更 大 ， 差 1 孔 ， 測(cè)定殘余 牛血 清 白蛋 白濃度 就可相 差 2 5nm l 。而本試劑盒可對(duì)在這些 數(shù)值之 間的含量 進(jìn)行精確定 量。③本試劑盒 測(cè)定樣 品中的 B S A含 量可代表樣品中的牛血清蛋 白含量 ， 不會(huì) 造成對(duì)后 者的“ 低估” ， 因此 ， 可作為牛血清蛋 白含量控制 的指 標(biāo) ， 見表 4 。表 4 不 同方 法測(cè)

18、定樣 品 中殘 余牛 血 清 白蛋 白( 1 I S A) 濃 度 ( n g ／ m 1 ) 的 比較 ’ V Z V ． D - 為 國產(chǎn)水痘疫苗 ： v 2 = 、 ， ． I ． 為進(jìn) 口水痘 疫苗 ； M e a s l e s 為麻疹 疫 苗 ； M M R - I 為進(jìn) 口麻風(fēng)腮 三聯(lián)疫 苗 ； J E為 乙型腦 炎疫 苗 。N A ： 未 提供 廠家測(cè)定結(jié)果 ．一 采用 的是 同一批 試劑 盒 ， 其 靈敏 度 在不 同

19、試 驗(yàn) 間， 可從 3 ． 1 2 5 ～1 2 ． 5n g ， I T d 。故導(dǎo)致制品中殘余牛血清白蛋白測(cè)定結(jié)果最低檢測(cè)限 不同 ．8 ． 協(xié)作驗(yàn)證 為考察本試劑盒的可操作 性和可重 復(fù)性 ， 由 3個(gè)不同單位進(jìn)行了協(xié)作驗(yàn)證 ， 按照統(tǒng)一操作步驟 ， 檢 測(cè)相同樣品 ， 包括進(jìn) 口制品和國內(nèi)制品 ， 以及不同種 類的疫苗制品 ， 結(jié)果檢測(cè)的重 復(fù)性和可操作性均較 好 ， 不同操作人員之間測(cè)定結(jié)果 的差異無顯著意義 ，見表 5 。如